李 颖，张 斌，杨 玲

（1.武警重庆总队医院皮肤科，重庆 400061；2.重庆市中医院皮肤科，重庆 400000；3.联勤保障部队第九二〇医院皮肤科，云南 昆明 650032）

TGFβ是一类对上皮细胞生长有潜在抑制作用的细胞因子。Smad7是TGFβ信号转导通路中最为重要的负性调节因子，Smad7表达升高可对TGFβ信号转导通路起到限制作用[1]。就皮肤鳞癌而言，除了皮肤老化、紫外线及多种因素参与鳞癌的发生，皮肤鳞癌与HPV的关系也日益引起关注。研究表明，HPV可与紫外线对皮肤的损伤形成叠加效应，提示HPV在鳞癌发生和发展中也发挥着积极作用。鉴于TGFβ作为上皮细胞中最重要的抑制细胞生长的细胞因子，在HPV16感染的肿瘤细胞中高表达却不能发挥抑制肿瘤增殖的作用，以及Smad7在肿瘤形成和转移过程中的重要作用，引起了笔者的深思。为此，笔者以HPV16与Smad7的关系作为研究切入点，检测皮肤鳞癌组织中HPV16 E7和Smad7的表达，并分析其表达与皮肤鳞癌临床病理特征的关系。

1 材料及方法

1.1 临床资料收集 门诊确诊皮肤鳞状细胞癌手术切除标本蜡块37例及正常皮肤标本（整形手术或创伤手术边缘皮肤）蜡块30例，皮肤鳞癌患者术前均未接受治疗。皮肤鳞癌中，男性21例，女性16例，年龄（41～82）岁，平均年龄57岁，皮损发生于头面部者19例，躯干部4例，生殖器部位2例，四肢12例，按分化程度划分为低分化癌11例，中分化14例，高分化12例。

1.2 方法 ① 免疫组化染色检测标本中Smad7和PCNA的表达：4μm厚石蜡切片按常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇溶液37℃孵育15min，枸橼酸盐抗原修复，分别滴加抗体工作液（兔抗人Smad7多克隆抗体或鼠抗人PCNA即用型单克隆抗体），4℃孵育过夜后，滴加50μl聚合物增强剂；37℃孵育20min，辣根过氧化物酶标记的第二抗体；37℃孵育30min，DAB显色，苏木素复染。中性树胶封片，镜下观察并照像，每步骤间均用PBS漂洗充分。在良好的组织结构及清晰的背景上细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。判断标准：观察胞浆Smad7的染色强度，分为（0～3）级。0级（0分），未着色即阴性；1级（1分），浅黄色即弱阳性；2级（2分），黄色即中等程度阳性；3级（3分），棕黄色即强阳性。对PCNA染色强度进行两级评分，既进行染色强度的分级，又进行细胞计数。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计数阳性细胞百 分 数。分 别 计 为0分（0）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。两种评分相乘作为最后的染色积分，其积分大于1被认为该组织切片免疫组化PCNA染色阳性。其中，（1～4）分为弱阳性（+）；（5～8）分 为 阳 性（++）；（9～12）分 为 强 阳 性（+++）。② PCR检 测HPV16 E7DNA：4 μm厚石 蜡包埋切片，3枚切片放入1.5ml Ep管中，加入0.5ml DEXPAT®试剂，水浴箱内100℃加热处理10min，12 000rpm，4℃离心10min，水层含有组织DNA；直接作为PCR反应的模板，进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃ 90s、94℃ 30s、54℃ 60s、72℃ 60s，共35循环，72℃ 5min。分别扩增HPV16 E7和人GAPDH的DNA片 段（HPV16 E7引 物：5′-ATGCATGGAGAT ACACCTACATTGC-3′，5′-TTATGGTTTCTG AGAACAGA TGGGG-3′，产物大小297bp；GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-ATGGT GGTGAAGACGCCAGT-3′，产物大小142bp）。取PCR扩增产物5μl，在2.5%的琼脂糖凝胶和0.5×TBE电泳液中电泳，电压为80V，约（80～100）min后，通过凝胶成像分析仪观察电泳图像，在GAPDH扩增出来的条件下，于Marker 300bp处有电泳条带出现者，说明扩增得到HPV16 E7基因，对阳性结果重复一次。③ 统计学分析：应用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，对HPV16 E7表达与Smad7表达的相关性及其与临床病理特征间的关系采用X2检验和确切概率法，P＜0.05表示有统计学差异。育30min，DAB显色，苏木素复染。中性树胶封片，镜下观察并照像，每步骤间均用PBS漂洗充分。在良好的组织结构及清晰的背景上细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。判断标准：观察胞浆Smad7的染色强度，分为（0～3）级。0级（0分），未着色即阴性；1级（1分），浅黄色即弱阳性；2级（2分），黄色即中等程度阳性；3级（3分），棕黄色即强阳性。对PCNA染色强度进行两级评分，既进行染色强度的分级，又进行细胞计数。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计数阳性细胞百 分 数。分 别 计 为0分（0）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。两种评分相乘作为最后的染色积分，其积分大于1被认为该组织切片免疫组化PCNA染色阳性。其中，（1～4）分为弱阳性（+）；（5～8）分 为 阳 性（++）；（9～12）分 为 强 阳 性（+++）。② PCR检 测HPV16 E7DNA：4 μm厚石 蜡包埋切片，3枚切片放入1.5ml Ep管中，加入0.5ml DEXPAT®试剂，水浴箱内100℃加热处理10min，12 000rpm，4℃离心10min，水层含有组织DNA；直接作为PCR反应的模板，进行PCR反应。PCR扩增条件：94℃ 90s、94℃ 30s、54℃ 60s、72℃ 60s，共35循环，72℃ 5min。分别扩增HPV16 E7和人GAPDH的DNA片 段（HPV16 E7引 物：5′-ATGCATGGAGAT ACACCTACATTGC-3′，5′-TTATGGTTTCTG AGAACAGA TGGGG-3′，产物大小297bp；GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，5′-ATGGT GGTGAAGACGCCAGT-3′，产物大小142bp）。取PCR扩增产物5μl，在2.5%的琼脂糖凝胶和0.5×TBE电泳液中电泳，电压为80V，约（80～100）min后，通过凝胶成像分析仪观察电泳图像，在GAPDH扩增出来的条件下，于Marker 300bp处有电泳条带出现者，说明扩增得到HPV16 E7基因，对阳性结果重复一次。③ 统计学分析：应用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，对HPV16 E7表达与Smad7表达的相关性及其与临床病理特征间的关系采用X2检验和确切概率法，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 HPV16 E7检出情况 37例皮肤鳞癌组织中共检出6例HPV16 E7阳性，在30例对照正常皮肤组织中，未检出HPV16 E7（见图1、图2）。

图1 PCR检测皮肤鳞癌组织中HPV16 E7基因表达的凝胶电泳图

图2 PCR检测正常皮肤组织中HPV16 E7基因表达的凝胶电泳图

2.2 免疫组化法检测Smad7在皮肤鳞癌中的表达大多数鳞癌细胞胞浆高表达Smad7（P＜0.01），染色呈棕黄至棕褐色（见图3），其中阳性和强阳性表达的共26例。此外，少数鳞癌组织脉管内皮细胞及间质细胞也有Smad7的散在表达，部分（5例）肿瘤组织不表达Smad7（见表1）。

图3 免疫组化法检测Smad7在正常皮肤和皮肤鳞癌中的表达（×200）

表1 免疫组化法检测Smad7的表达

2.3 PCNA在皮肤鳞癌组织中的表达 37例皮肤鳞癌组织中均有PCNA的阳性表达（见图4），其中强阳性例数为22例，胞核PCNA表达强度与鳞癌增殖程度具有显著相关性（见表2）。

图4 免疫组化检测PCNA在正常皮肤和皮肤鳞癌中的表达（×200）

表2 免疫组化法检测PCNA的表达

2.4 比较统计学分析HPV16 E7和Smad7的表达及与皮肤鳞癌临床病理特征的关系 HPV16 E7表达与皮肤鳞癌发生部位和性别无明显相关性（P＞0.05），HPV16 E7表达与淋巴结转移和组织分化程度相关（P＜0.05），Smad7表达与患者的性别和皮肤鳞癌发生的部位无明显相关性（P＞0.05），Smad7表达强度与组织分化（P＜0.05）、淋巴结转移（P＜0.01）均相关，HPV16 E7表达分别和Smad7和PCNA的阳性表达相关（P＜0.05），Smad7和PCNA的阳性表达也显著相关（P＜0.01）（见表3）。

3 讨论

肿瘤的发生和恶性变是一个受多基因调控、机体内外环境均有参与的复杂过程，在肿瘤发生淋巴结转移这一过程中，多种细胞因子或生长因子参与调控。正常情况下，TGFβ可对表皮发挥抑制增殖的作用。Smad蛋白是TGFβ信号从膜受体到胞核的细胞内转导分子和调节分子。Smad7是TGFβ信号转导通路中最为重要的负性调节因子，Smad7表达升高可对TGFβ信号途径起到限制作用[2]。在繁衍成功并惟一稳定传代成一系的敲除角蛋白5并高表达Smad7（BK5.Smad7）的小鼠后代中也发现，与同胎的非转基因正常小鼠相比，BK5.Smad7成年小鼠在无UV照射的正常饲养状态下呈现出明显的皮肤老化表现，个别小鼠面部甚至出现自发性皮肤肿瘤。这提示Smad7表达升高可能是动物自发性皮肤肿瘤的重要始因[3]。前期细胞试验也显示稳定高表达 HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高，并可以影响Smad7的细胞定位[4]。本研究实验结果显示，人皮肤鳞状细胞癌组织中存在着Smad7表达增加。

表3 HPV16 E7和Smad7的表达与皮肤鳞癌临床病理特征的关系

HPV根据致病能力分为高危型和低危型，HPV16是最为常见的一种高危致病型，HPV16 E7已被确认为是一种重要的原癌蛋白，能够绕过细胞周期检测位点，破坏细胞周期的负调控最终诱导恶性肿瘤的发生。临床病理研究证实，除了在宫颈癌中被广泛（90%以上）检出，HPV16也可以在头颈部鳞状细胞癌以及消化道癌、膀胱癌、肺鳞状细胞癌和阴茎癌等人类多种上皮组织恶性肿瘤中被检出[5-8]，这提示HPV16与上述鳞癌发生有密切关系。

TGFβ在宫颈癌等HPV16感染的肿瘤组织中表达升高，却并没有抑制肿瘤的生长。现有研究提示：HPV16 E7可通过多种方式阻遏TGFβ发挥抑制细胞增殖的作用。在HPV16感染的恶性肿瘤细胞中发现，携带有TGFβ受体和相关Smads基因的染色体发生缺失。HPV16 E7能够竞争性抑制TGFβ上调p16、p21、p27及p15等CKIs的表达 和 活 化 的能力，使TGFβ抑制细胞周期过快的作用无法正常发挥。使用RNAi干扰技术特异性抑制HPV16 E7的表达，能够诱导p53、p21向核内聚集，并且可使R-Smad恢复对TGFβ的反应性，从而抑制肿瘤细胞的生长并且促进肿瘤细胞的凋亡。我们推测，外源性HPV16 E7也极可能通过与重要的抑制性Smad蛋白——Smad7发生作用，导致TGFβ对P21等CKIs诱导表达的作用丧失，加剧细胞周期的紊乱，进而促使角质形成细胞失控性增殖，加剧皮肤鳞癌的恶性程度和侵袭性[9-11]。

为此，我们以HPV16与TGFβ信号转导通路中重要的抑制性因子Smad7的关系为研究切入点，检测皮肤鳞癌组织中HPV16 E7和Smad7的表达，并分析其表达与皮肤鳞癌临床病理特征的关系。我们发现Smad7在皮肤鳞癌组织中表达上调，尤其是HPV感染的皮肤鳞癌组织，其Smad7的表达强度更高。通过比对临床资料进行分析显示：HPV16 E7的表达与皮肤鳞癌的低分化、淋巴结转移呈正相关；此外，HPV16 E7的表达分别与Smad7和PCNA的表达强度显著相关；Smad7蛋白的表达强度和皮肤鳞癌的分化和淋巴结转移也有相关性。因此我们推测，HPV16 E7可能通过联合或直接上调Smad7的表达来加速肿瘤细胞增殖和侵袭，有必要更深入研究HPV16 E7与Smad7在肿瘤发生发展中的密切关系。