◎ 田露露，蒋德意，韩 迪

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

青春双歧杆菌有免疫调节作用，可以缓解免疫衰老带来的有害作用及衰老相关的病理作用，因而可以抵制与衰老相关的疾病。青春双歧杆菌是主要产 γ-氨基丁酸的菌，因而作用于肠-脑轴[1-3]。青春双歧杆菌是严格厌氧菌，培养条件要求苛刻，而且培养基成分对其生长影响很大，因而体外培养很难达到较高的活菌数[4]。

双歧杆菌培养基中的主要影响因素有碳源、氮源、还原剂、生长因子等，培养基中碳源一般由葡萄糖，乳糖等提供，氮源一般有胰蛋白胨、蛋白胨、酵母抽提物等[4]。L-半胱氨酸可以降低氧气的抑制作用[4]。无机盐类比如铁、镁、锌、钙、锰等元素的盐都是其生长必不可少的[5-6]。主要生长因子还有低聚糖类，如低聚果糖，低聚半乳糖等；蛋白质水解产物及一些蛋白质类物质，如乳清蛋白、酪蛋白水解产物、酵母提取液、牛肉浸液、大豆胰蛋白酶水解产物、糖多肽等[4]。

提高双歧杆菌活菌量的主要途径有改进培养基成分；通过耐氧驯化，降低培养条件；改进保护剂等，目前已有青春双歧杆菌培养工艺的优化研究，多数集中在发酵培养基及冻干保护剂的研究，且活菌数低，仅为109cfu·mL-1[4-10]。本文从生产工艺的各个方面，如发酵、计数、冻干等方面确定最佳参数，从而提高冻干粉中青春双歧杆菌的活菌数。

1 材料与方法

1.1 材料

青春双歧杆菌，润盈生物工程（上海）有限公司提供；TPY培养基、BBL培养基，青岛海博；蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏、酵母粉、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、吐温-80、磷酸氢二钾、半胱氨酸盐酸盐、硫酸镁、硫酸锰、胰蛋白胨、乳糖、氯化钠、琼脂、番茄浸粉、肝浸粉、酵母浸粉、淀粉、L-半胱氨酸、水解酪蛋白、大豆胨、氯化镁、硫酸锌、氯化钙、氯化铁、海藻糖、甘露糖、脱脂奶粉、葡萄糖、乳糖、低聚果糖、麦芽糊精、吐温-80、赖氨酸、谷氨酸钠、甘油、明胶、谷氨酸、甘露醇，VC均来自国产；Solarbio细菌基因组DNA提取试剂盒。

1.2 仪器设备

GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；UV-2102C紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；电热恒温培养箱BPX-162，上海颖汉化工科技有限公司；SIM FD8-6冷冻干燥机；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；Olympus CX31生物显微镜；Mettler Toledo FiveEasy实验室pH计；BioFlo/CelliGen 115玻璃通气发酵罐；BIO-RAD S1000 Thermal Cycler PCR仪；BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像分析系统

1.3 方法

1.3.1 青春双歧杆菌菌种鉴定

用培养基对菌种进行活化培养，镜检，确定是否为纯培养物，同时排除明显不是双歧杆菌的菌株；取上述处于对数生长期的发酵液进行16s鉴定，包括提取DNA、PCR、电泳、送出测序及比对分析，选择青春双歧杆菌进行后续实验。

1.3.2 青春双歧杆菌活菌计数法

在确定计数用培养基的同时，确定培养方法。具体实验过程如下。①选择上述确定的菌种，用培养基进行摇瓶发酵。②配制4种计数用固体培养基，详见表1。③取摇瓶发酵液，采用梯度稀释方法和倾注法进行活菌计数，分别用4种不同固体培养基进行倾注培养。④采用厌氧盒法进行厌氧培养。⑤选择平板上活菌数最高的作为计数用培养基，同时选择重现性高的培养方式作为最佳培养方法。

表1 计数方法研究中培养基配方组成表

1.3.3 冻干过程优化

冻干粉活菌数不高的关键原因是冻干，在冻干过程中菌体大量死亡，所以将冻干过程优化作为主要问题来解决。实验过程如下。①上罐发酵，制备青春双歧杆菌菌泥。②选择12种不同的保护剂，详见表2，离心乳化，用实验室SIM冻干机冻干。③各冻干粉活菌计数。④分析实验结果，找出在冻干过程中可能对青春双歧杆菌起有效保护的物质和保护剂配方。⑤将有效物质和活菌数最高的保护剂配方中物质组合，通过单因素和正交实验确定保护剂中各成分最佳用量。⑥反复验证筛选出的几种保护剂，选择保护效果较好的保护剂。⑦对乳化液中各保护剂与菌泥的添加比例进行优化，分别设置保护剂与菌泥几种不同比例，进行冻干计数，确定保护剂的最佳添加比例。⑧选择最优的一种保护剂及其与菌泥的最佳添加比例，算出乳化液中固形物浓度及保护剂中固形物浓度，设计不同乳化液中固形物浓度，进行实验，确定不同固形物浓度对冻干粉中活菌数的影响。⑨重复实验，选择实验中最优保护剂，及此保护剂的最佳添加量，进行后续实验。

表2 冻干保护剂配方组成表

1.3.4 发酵过程优化

按照发酵培养基设置的基本原理，调整碳氮源比例配制8种培养基，详见表3，尽可能提高发酵液OD值，同时保持菌体形态不出现异常；发酵终点判断，发酵液不同生长时间段放罐，离心冻干及活菌计数。选择发酵液OD值高，生长速度快，且菌体形态无异常，最终冻干粉活菌数高的培养基，作为最优培养基。同时选择冻干粉中活菌数高，全过程收率最高时作为发酵终点。

表3 发酵培养基配方表

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

选用公司菌种编号分别为003、184、446、1021、1203、0422和1020共7株疑似青春双歧杆菌的菌种中，利用16SrDNA鉴定技术，经过4次反复鉴定，最终确认0422为青春双歧杆菌，其正反向序列如图1。在NCBI Blast项目上进行比对，其结果如图2。

图1 青春双歧杆菌正反向序列图

图2 序列比对结果图

2.2 计数方法研究

计数方法中培养基配方见表1。计数研究中不同培养基计数结果见表4，培养基2（MRSB培养基）中活菌数最高，菌落较大，且大小均一，选其作为青春双歧杆菌计数用培养基。

表4 计数研究中不同培养基计数结果表

2.3 冻干过程优化

本文比较了12种不同配方的保护剂，冻干保护剂配方见表2。实验显示，用配方2作保护剂时，冻干粉中活菌数最高，结果见表5。因此将它作为基础配方，对其进行正交实验，进一步优化，正交实验设计及结果见表6。

表5 不同保护剂对冻干粉活菌数的影响表

表6 冻干优化正交实验结果表

根据正交实验结果，可得出如下结论。①各因素对冻干粉活菌影响作用大小的顺序为：谷氨酸钠＞脱脂奶粉＞麦芽糊精＞葡萄糖＞淀粉＞赖氨酸＞海藻糖。②最佳保护剂配方为：海藻糖2%，脱脂奶粉1%，葡萄糖1%，麦芽糊精1%，淀粉7%，赖氨酸2%，谷氨酸钠3.5%，水82.5%。

再次对保护剂配方进行验证，验证后得出：正交实验2配方活菌数为3.8×1010cfu·g-1,正交实验7配方活菌数为4.2×1010cfu·g-1，正交实验优化后配方活菌数为2.6×1010cfu·g-1。从实验结果看出，优化后，保护剂Ⅰ（正交实验2）冻干粉活菌数是优化前（2.2×1010cfu·g-1）1.7倍，保护剂Ⅱ（正交实验7）冻干粉活菌是优化前1.9倍，保护剂Ⅲ（正交实验优化后配方）冻干粉活菌数是优化前1.2倍。继续选择这 3种保护剂进行乳化液中保护剂与菌泥比例优化实验，比较验证这3种保护剂的效果，结果见表7。表7中实验结果可知，在冻干过程中，用保护剂Ⅲ（正交实验优化后配方）作青春双歧杆菌保护剂，当乳化液中保护剂：菌泥比例为2∶1时，保护效果最好，冻干粉中活菌数最高，保护剂Ⅰ和Ⅱ的保护效果略差，因此，选择保护剂3进行乳化液固形物含量实验，结果见表8。从表8可以看出，青春双歧杆菌在冻干过程中，用表7中保护剂Ⅲ作保护剂时，乳化液中固形物浓度为33.5%，冻干粉中活菌数最高，因此选择乳化液中固形物浓度为33.5%，即乳化液：菌泥=2∶1时，进行后续实验，反复验证。

表7 乳化液中保护剂与菌泥比例优化实验结果表

表8 乳化液固形物含量实验结果表

实验选择保护剂Ⅲ作为保护剂，乳化液中保护剂∶菌泥=2∶1，其余条件不变，重复实验，结果为冻干粉活菌数9.3×1010cfu·g-1，与之前实验数据比较，波动不大，因此可得出如下结论：青春双歧杆菌最优冻干保护剂为：海藻糖2.0%，脱脂奶粉1.0%，葡萄糖1.0%，麦芽糊精1.0%，淀粉7.0%，赖氨酸2.0%，谷氨酸钠3.5%，水82.5%；乳化液中保护剂：菌泥固形物=2∶1。

2.4 发酵过程优化

表3列举了8种不同的培养基配方，表9为这8种培养基配方对发酵活菌数及pH的影响，综合考虑青春双歧杆菌生长速度、菌体形态、生物量及冻干粉活菌数等各方面因素，最终选择培养基7作为最佳配方。

以表9中培养基7为发酵培养基，选用优化后的青春双歧杆菌保护剂作为实验用保护剂，分别在发酵7.0 h 和8.5 h时，放罐并冻干计数，结果表明，发酵7 h 时，活菌数为2.6×1010cfu·g-1，发酵8.5 h时，活菌数为1.6×1010cfu·g-1。在发酵7 h时，即发酵液OD600值刚达到最大，发酵液中菌体刚进入稳定期时放罐，冻干粉中活菌数最高。延期放罐，总活菌数会损失30%，因此，青春双歧杆菌发酵时，最佳的发酵终点是发酵液中OD值增速放缓，即将达到最大值时对应的时间点，此时菌体刚进入稳定期。

表9 各培养基培养后pH及活菌数差异表

3 结论

青春双歧杆菌菌株经过16srDNA鉴定后，经过计数，发酵，保护剂工艺优化后，实验室中发酵液OD值，冻干粉活菌数都有明显提高，并且确定了最优发酵时间7 h。优化前冻干粉活菌数为109CFU·g-1，优化后最高为9.3×1010CFU·g-1。优化前OD600值为5.96，优化后为16.25。