陈思攀，杨耀博，焦 阳，颜昭勇

(陕西省人民医院介入放射科,陕西 西安 710068)

肝癌是我国一种常见的、高发的恶性肿瘤，我国每年新增肝癌患者占全球新增的55%，对该病的诊治形势依然十分严峻[1]。目前首选治疗为手术切除，但大部分肝癌患者伴有肝硬化，使手术切除量有一定的限制[2]。近年来，经导管动脉内栓塞(Transcatheter arterial embolization，TAE)介入治疗逐渐成为主要方法之一，但术后远期疗效仍不理想，复发及转移率高[3]。基因治疗领域的重要发现之一是小干扰核糖核酸(Smallinterfering ribonucleic acid,siRNA)，为肝癌的靶向治疗提供了新的治疗手段，为不能手术患者的提供了新的途径[4]。siRNA能特异地结合细胞内靶mRNA形成沉默复合体，进而阻断或减少下游蛋白质的合成，此为RNA干扰现象。siRNA诱导的基因沉默特异性高、操作简单、周期短，应用前景广阔[5]。经导管动脉内栓塞能加重缺氧微环境，升高肝癌细胞缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的基因表达，继而引起血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的异常高表达，刺激肿瘤细胞的增殖[6-7]。本研究通过建立VX2肝癌兔模型，考察TAE联合siRNA干扰HIF-1α对肝癌兔的疗效及对HIF-1α、VEGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器与试剂：HIF-1α多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，HIF-1α shRNA购自美国Santa Cruz公司，大规模质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司，质粒小量中提试剂盒购自北京天根生化，注射用青霉素钠购自华北制药，血管鞘、Cobra导管等购自Terumo；聚乙烯醇(PVA)微粒购自Cook公司，光学显微镜(OlympusBX53)购自Olympus，Philips Brilliance 64层螺旋CT购自荷兰飞利浦公司，自动生化分析仪(BA-200FR)购自日本东芝公司。

1.1.2 实验动物：以20只2～3个月龄的雄性新西兰大白兔为研究对象，体重2.0～2.5 kg，由杭州余杭科联兔业有限公司提供，许可证号SCXK(浙)2017-0004，合格证号1805160014。试验前进行6 d的适应性单笼饲养，温度20～25 ℃，湿度40%～70%。荷瘤种兔1只，VX2由日本Funbanski公司引进。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立：VX2瘤株从荷瘤兔中获得，将生长完好的实性部分裁剪成1 mm3(长×宽×高为1 mm×1 mm×1 mm)的组织块，放置备用。将实验兔麻醉、开腹及暴露肝脏后，在肝左叶部位植入剪好的肿瘤组织块，用明胶海绵压迫止血，回纳肝脏于腹腔中，逐层缝合实验兔腹壁肌肉、皮肤。术后需保温处理，直到实验兔苏醒，苏醒后放置在笼中，独立饲养，每日肌肉注射1万U/kg青霉素，维持3 d，术后两周所有实验兔全麻下，行MRI 检查，纳入研究标准：肿瘤最大径<3 cm，且坏死灶<瘤体直径1/2者，位于肝实质内，信号均匀。研究中造模兔无脱失，全部纳入结果分析。

1.2.2 HIF-1α-shRNA的合成：第一步构建HIF-1α-shRNA病毒载体，第二步提取质粒，以shHIF-1α质粒对293A细胞进行转染，获得腺病毒。以腺病毒对原代兔皮肤成纤维细胞进行感染，于48 h后检测HIF-1α mRNA的表达，对shRNA进行筛选，以HIF-1α基因敲降效率最高的作为目标HIF-1α-shRNA。

1.2.3 治疗方法：采用随机数字表法将所有肝癌模型兔分为两组，每组10只，所有实验兔均采用1%戊巴比妥钠(3 ml/kg)耳缘静脉麻醉，进行股动脉穿刺，穿刺成功后导入4F血管鞘，将4F Cobra导管插入腹腔干，以0.5 ml/s流率手推3 ml的对比剂 Omnipaque 350，以进行腹主动脉造影，再将2.7F同轴微导管置入肝左动脉内，DSA造影确认移植瘤由肝左动脉供血。两组动物在DSA透视导向下，对照组将PVA微粒与对比剂混悬液缓缓注入肝左动脉，至肿瘤供血动脉血流完全停滞；研究组注入PVA微粒与对比剂混悬液及含有慢病毒颗粒的转染溶液 (含HIF-1α shRNA)，注入量为0.6 nmol/L。

1.3 观察指标 ①肿瘤体积：分别于术前1 d和术后28 d，采用螺旋CT进行扫描，测量各组实验兔肿瘤体积。②肝癌组织核分裂象总数：于治疗后28 d，处死实验兔，进行病理学以及免疫组织化学检查。于100倍镜下计算肿瘤区域核分裂象总数。③HIF-1α 蛋白和VEGF蛋白的表达：采用免疫组织化学法，测定肿瘤组织HIF-1α 蛋白、VEGF蛋白的表达情况。④门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸基转移酶(ALT)水平：分别于术前1 d和术后28 d，采集两组耳缘静脉血，以自动生化分析仪测量两组血浆AST、ALT水平。

2 结 果

2.1 两组肝癌模型兔肿瘤体积变化 见表1。治疗前两组肿瘤体积比较无统计学差异(P>0.05)；治疗后两组肿瘤体积均有一定程度的增加，与治疗前比较，对照组差异有统计学意义(P<0.01)，研究组差异无统计学意义(P>0.05)；组间比较，研究组治疗后肿瘤体积显著降低(P<0.01)。

表1 两组肝癌模型兔肿瘤体积变化(mm3)

2.2 两组核分裂象总数比较 见表2。 研究组核分裂象总数显著低于对照组(P<0.05)。

表2 两组核分裂象总数比较(个)

2.3 两组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达比较 见表3。研究组肿瘤组织HIF-1α表达量显著低于对照组(P<0.01)，研究组肿瘤组织VEGF表达量显著低于对照组(P<0.01)。

表3 两组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达比较(pg/ml)

2.4 两组血浆AST和ALT比较 见表4。治疗前两组ALT和AST水平比较均无统计学差异(均P>0.05；治疗后两组ALT、AST水平均高于治疗前(均P<0.01)；与对照组相比，研究组治疗后ALT和AST水平均显著降低(均P<0.01)。

表4 两组血浆AST和ALT比较(U/L)

3 讨 论

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在亚洲地区和非洲部分地区发病率高，患者年龄大部分在40～50岁，我国每年新增肝癌患者以及肝癌死亡人数居全球首位，是我国第三的肿瘤死亡原因以及发病率第四高的恶性肿瘤，其发生常与人们的生活习惯的等有关，一直以来，如何对肝癌进行有效的预防和治疗都是研究热点。手术为首选治疗方式，但80%以上患者伴有肝硬化，使得肝切除量受到限制，同时，部分肝癌部位接近第一、第二、第三肝口，为手术治疗造成很大困难，因此，临床上能进行手术切除的患者较少[8]。近年来，TAE逐渐成为治疗肝癌的主要手段之一，但远期疗效有限，可能与TAE治疗后产生缺血缺氧、坏死，肿瘤组织逐渐对缺氧微环境产生适应性有关[9-10]。

基因沉默是近年来基因治疗领域的重要进展，其作用机制包括位置效应、转录水平和转录后水平[11-12]。RNA干扰为一项新兴的基因阻断技术，是一种由双链RNA分子所介导的序列特异性转录后引起基因静默的过程，表现为双链RNA分子在mRN A水平选择性关闭相关基因的表达。在多种肿瘤的治疗中有广阔的发展前景，siRNA水平基因调控的结果为转录后水平基因沉默，该途径对靶基因特异度高，毒性小，不与染色体 DNA相互作用，且诱导靶细胞基因突变的风险较低[13-14]。本研究通过siRNA干扰沉默HIF-1α基因，以抑制TAE 治疗后的肿瘤缺氧适应，从而抑制肿瘤血管生成。结果显示，治疗前两组肿瘤体积比较无统计学差异；治疗后两组肿瘤体积均有一定程度的增加，与治疗前比较，对照组差异有统计学意义；研究组无统计学意义；组间比较研究组治疗后肿瘤体积显著降低。对两组核分裂像总数进行比较，结果显示，研究组核分裂像总数显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义。即TAE联合siRNA干扰能有效的抑制肝癌兔肿瘤组织的生长。

HIF-1α在肝癌兔肿瘤组织的缺氧适应中能调控VEGF、IL-6以及TNF-α等多种肿瘤因子的表达[15-16]。其中血管生成调控因子特异性和作用最强的是VEGF，其产生并分泌于肿瘤细胞，具有促进内皮细胞的分裂和生长作用，进而诱导新生血管形成，且VEGF能上调BCL-2的表达，从而抑制肿瘤的凋亡，进而促进肿瘤的生长[17-18]。本研究对两组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达量进行检测，结果显示，研究组肿瘤组织HIF-1α表达量、VEGF表达量低于对照组。表明TAE联合siRNA能显著抑制缺氧后靶部位HIF-1α和VEGF的蛋白表达。其机制可能在于，TAE能闭塞肿瘤供血动脉，改变肿瘤部位血流动力学，导致HIF-1α-shRNA慢病毒载体长时间停留于靶部位，提高了转染效率；缺氧环境中HIF-1α呈高表达状态，但HIF-1α-shRNA能抑制其表达，进而抑制肝癌组织中新生血管的生成，使癌细胞处于持续缺氧、坏死和凋亡状态，进而提高TAE疗效[19-20]。

药物只要通过肝脏和肾脏进行排泄，易在该部位聚集产生毒性，因此本研究对两组治疗前后两组血浆AST和ALT水平进行比较，结果显示治疗前两组ALT和AST水平比较均无统计学差异；治疗后两组ALT、AST水平均高于治疗前；与对照组相比，研究组治疗后ALT和AST水平均显著降低。表明HIF-1α-shRNA在抑制肿瘤的生长的同时，未增加肝癌兔的肝肾毒性，而对照组的ALT和AST水平更高，说明可能肿瘤本身对于肝肾功能损害更严重。

综上所述，TAE联合siRNA干扰HIF-1α能通过降低HIF-1α和 VEGF蛋白表达量抑制肝癌兔肿瘤的生长。