唐一萍，冯 俊，马 鹏，罗德艳

(南充市中心医院 川北医学院第二临床医学院耳鼻咽喉头颈外科，四川 南充637000)

近年，随着我国城市化以及工业科技的不断发展，噪声污染日益严重。噪声性耳聋成为了军事、建筑业、工业、娱乐业、交通行业等最常见的听力致残因素。以往有研究报道[1]，噪声性耳聋与耳蜗组织发生机械性损伤以及代谢障碍密切相关。人体长时间处于噪声环境中过度的刺激会导致耳蜗毛细胞坏死或凋亡。而随着对噪声性耳聋发生机制的不断深入研究，有学者发现噪声性耳聋的发生受环境、基因双重因素所影响[2-3]。miRNA在生物体发生发展过程中的作用已有多项基础研究所证实，其中，miRNA-183家族在内耳中含有丰富的表达，且在内耳发育过程中有着重要的调控作用[4]。相关研究[5]表明，miRNA-183家族与听力受损具有一定的相关性。本研究通过动物实验研究miRNA-183在噪声性耳聋大鼠耳蜗组织中的表达情况，并尝试分析其对噪声性耳聋发生发展的影响，旨在为噪声性耳聋的诊疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型 50只健康SD大鼠，均由四川大学实验动物中心提供，25只雄鼠，25只雌鼠，体重100～200 g,8周龄，自由喂养，不限制饮食，而且大鼠的耳廓反射均灵敏，无噪声接触史、耳毒药物服用史或中耳炎等。将50只SD大鼠分为两组，其中，将10只SD大鼠不予任何处理设为空白对照组，另40只大鼠均进行噪声暴露以建立噪声性耳聋动物模型，将其分为噪声暴露1 d组(n=10)、噪声暴露7 d组(n=10)、噪声暴露14 d组(n=10)、噪声暴露28 d组(n=10)。本研究实验内容、实验方法等均遵循了《实验动物管理与使用指南》(科学出版社出版)，均经医院伦理委员会审批同意。

1.2 噪声性耳聋动物模型建立 在隔音房内利用白噪声播放软件播放白噪声，将音量调至最大，噪声强度设置为120 dB SPL，将实验大鼠头部放到声源正前方2 cm处，每日持续噪声暴露4 h，连续4 d，建立噪声性耳聋动物模型。

1.3 耳蜗基底膜镜检 对照组及各组噪声暴露后立即进行大鼠断头处死，即刻去除双侧听泡，放在PBS溶液中浸泡，借助手术放大镜将蜗壳去除，并将基底膜连带蜗轴取出，置于-80 ℃低温冷冻环境中储存。取适量耳蜗基底膜铺片，并予以0.5%硝酸银溶液进行染色，在生物显微镜(10×40)视野下察看耳蜗毛细胞受损情况，与正常耳蜗毛细胞相比，受损的毛细胞会出现不规则排序，或在正常毛细胞排列中有空缺等。计算出各组耳蜗基底膜中外毛、內毛细胞的缺失率，并以此作为毛细胞损伤判断指标。内外毛细胞缺失率计算方法：在显微镜下应用目镜中长度0.24 mm标尺对耳蜗基底膜顶回至底回毛细胞存活/缺失数目进行计数，并与顶回顶点的距离形成线性函数关系，借助Sigma Plot软件回执耳蜗毛细胞图，且应用耳蜗毛细胞定量分析软件计数毛细胞缺失率。

1.4 miRNA-183测定

1.4.1 试剂与仪器：Trizon总RNA提取试剂(上海联迈生物)，Fast Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒(上海一基生物)，Ultra SYBR Mixture试剂盒(上海研谨生物)，Bio-Rad CFX384实时定量PCR仪(美国伯乐)，T10手持式匀浆机(德国IKA)，超低温冰箱(松下)，AL104电子天平(瑞士梅特勒)，TG-16S微量高速离心机(上海锦玟)，Olympus CX22双目显微镜。

1.4.2 操作方法：①总RNA提取：取各组耳蜗组织样本应用手持式匀浆机将其碾碎，研磨成粉末状置于EP管中，按照35 mg样本加入1 ml Trizon液的比例加入适量Trizon液混匀，并反复进行吹打以使样本充分裂解。将样本在室温中静置5 min，待蛋白核酸复合物完全分离后再在EP管中添加0.2 ml的氯仿溶液，剧烈震荡，室温放置5 min后进行离心处理(1200 r/min，4 min)。另取新EP管，往内加入分离后的上清液300 ml、异丙醇溶液500 μl混匀，在4 ℃环境中放置20 min。再次以相同条件进行离心处理80 min，将沉淀物取出，用75%酒精洗涤，离心处理4 min，弃上清液。待沉淀物晾干后添加二乙基焦碳酸酯处理水20 μl混匀震荡以溶解RNA。②cDNA合成：应用RT-PCR法进行检测，取5 μl RNA为逆转录模板，miRNA-183的相对表达量以U6 RNA为内参基因，严格按照Fast Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒进行操作，加入引物(正向序列：5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’；反向序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’)充分震荡混匀，并予以短暂离心处理以使溶液集中于EP管底。然后将其置于42 ℃环境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后对其进行短暂离心处理，并放在冰上冷却获得逆转录产物cDNA。③实时定量PCR反应：严格按照Ultra SYBR Mixture试剂盒说明书进行荧光实时定量PCR实验，设置反应条件：预变性95 ℃,10 min，变性95 ℃,15 s，退火/延伸60 ℃,1 min，40个循环，并应用实时定量PCR仪测定循环阈值(Ct)，每组样品作3个复孔，取平均值。以2-△△Ct法表示各组miRNA-183的相对表达量，其中，△Ct=目的基因Ct均值-内参基因Ct均值，△△Ct=待测样本△Ct值-校正器△Ct值。

1.5 观察项目 ①比较各组大鼠耳蜗基底膜的外毛细胞、內毛细胞缺失率;②比较各组大鼠耳蜗组织的miRNA-183相对表达量。

1.6 统计学方法 数据录入到Microsoft Excel 2013软件中，并进行逻辑性整理，删除不合逻辑的数据，然后再采用SPSS 23.0统计学软件处理，计量资料采用不假定方差齐性Brown-ForsytheF统计量作为校正值进行方差分析，同时应用不要求方差齐性的Tamhane事后检验，且两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠耳蜗基底膜外內毛细胞形态 镜检下见空白对照组大鼠的耳蜗基底膜有1排內毛细胞、3排外毛细胞，排列整齐，无毛细胞缺失(图1)，经单因素方差分析以及Brown-Forsythe检验结果显示，不同噪声暴露时间内膜细胞缺失率无统计学差异(F=1.571，P=0.215)。而Brown-Forsythe检验结果显示，不同噪声暴露时间之间的外毛细胞总缺失率有统计学差异(F=69.401，P=0.000)。Tamhane事后检验发现，噪声暴露28 d组、噪声暴露14 d组、噪声暴露7 d组的外毛细胞缺失率均显著高于噪声暴露1 d组(均P<0.01)，且噪声暴露28 d组的外毛细胞缺失率明显高于噪声暴露14 d组、噪声暴露7 d组(均P<0.01)。见表1。

图1 空白对照组大鼠耳蜗基底膜铺片镜检结果(OHC外毛细胞，IHC内毛细胞)

表1 不同噪声暴露组大鼠耳蜗基底膜外內毛细胞缺失率比较(%)

2.2 各组大鼠耳蜗组织miRNA-183相对表达量比较 经单因素方差分析以及Brown-Forsythe检验结果显示，空白对照组、不同噪声暴露时间之间的miRNA-183相对表达量差异均有统计学意义(F=99.728，P=0.000)。Tamhane事后检验发现，噪声暴露28 d组、噪声暴露14 d组、噪声暴露7 d组、噪声暴露1 d组的miRNA-183相对表达量显著低于空白对照组(均P<0.01)。噪声暴露1 d组、噪声暴露7 d组的大鼠耳蜗组织miRNA-183相对表达量明显低于噪声暴露14 d组、噪声暴露28 d组(均P<0.01)，且噪声暴露14 d组的miRNA-183相对表达量显著低于噪声暴露28 d组(t=4.988，P=0.000)。而噪声暴露1 d组、噪声暴露7 d组之间miRNA-183相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.980，P=0.063)。见表2。

表2 各组大鼠耳蜗组织miRNA-183相对表达量比较

3 讨 论

近年，随着临床对内耳损伤机制研究的不断深入，已有大量研究证实[6]，耳蜗基底膜毛细胞在内耳的正常发育、损伤修复中发挥重要的基础，同时也是多种内耳疾病发生发展的病理生理基础。动物实验研究发现[7]，经高强度噪声暴露后大鼠的耳蜗受损区内存有坏死毛细胞。Blioskas等[8]的研究将健康成年豚鼠置于声压级55 dB SPL、频谱2000 Hz噪声环境中国暴露28 d，发现其耳蜗内有大量的毛细胞坏死、凋亡。相关文献[9-10]也报道，永久性听力阈移的病理生理基础是耳蜗内毛细胞出现不可逆性病理损害，致使毛细胞缺失，而且在此过程中最易受到损害的是外毛细胞，其次是支持细胞，最后为内毛细胞。本研究经硝酸银溶液染色镜检后发现，空白对照组大鼠的耳蜗基底膜內毛、外毛细胞排列整齐，无细胞缺失，而噪声暴露1 d组、噪声暴露7 d组、噪声暴露14 d组、噪声暴露28 d组的耳底基膜外毛细胞缺失率随噪声暴露时间延长而显著升高，与上述研究报道相符，进一步证实了在噪声性耳聋发生中会出现毛细胞病理损伤，且最早出现变化的是外毛细胞。但本研究发现，在噪声暴露的28 d以内内毛细胞无病理性损害，与Peyvandi等[11]的研究结果不相符，笔者推敲可能是本研究在噪声性耳聋模型建立中的噪音强度、持续时间不足所导致的。

此外，miRNA在内耳中的表达情况及具体功能研究成为了热门的话题。miRNA是由21～25个小分子核苷酸所组成的非编码RNA，可广泛分布在哺乳动物基因组[12]。其中，有研究[13-14]报道，miRNA-183在多项疾病的病变组织中均会出现异常表达，能够参与细胞凋亡、分化、增殖等许多重要生物学过程。Weston等[15]对小鼠胚胎期到成年期的耳蜗发育情况进行分析研究，发现miRNA-183家族成员在耳蜗发育过程中呈动态性表达，且在耳蜗结构成形、分化中达到峰值。Yang等[16]的研究证实，miRNA-183能够在一定程度调控内耳毛细胞的分化、发育及成熟过程。本研究对不同噪声暴露时间大鼠的miRNA-183表达水平进行比较发现，噪声暴露1、7、14、28 d大鼠的耳蜗miRNA-183表达量较空白对照组逐渐降低。王园园等[17]的研究证实，在噪声暴露期间耳蜗毛细胞会发生变性、坏死及缺失，促使听力受损。故笔者结合本研究结果推测噪声刺激对听力的损伤可能与miRNA-183表达水平下降有关。与此同时，本研究经事后检验显示，噪声暴露14、28 d的miRNA-183表达水平较噪声暴露1、7 d明显升高。相关文献[18-19]指出，噪声暴露过程中除了耳蜗毛细胞会出现缺损改变外，其耳蜗组织内残存的毛细胞会发生代偿性修复，促使祖细胞向毛细胞分化，使残存的毛细胞具有一定的再生、恢复能力。此说法也可以解释本研究miRNA-183表达水平在噪声暴露14、28 d逐渐升高的原因，但需注意镜检结果显示噪声暴露14、28 d外毛细胞缺失率仍较噪声暴露1、7 d增加，表明了大鼠耳蜗组织受损后残存毛细胞的再生修复能力是有限的[20]。

综上所述，miRNA-183在噪声性耳聋大鼠耳蜗组织中呈低表达，推测miRNA-183表达量下调可能会促进噪声性耳聋发生发展，而且对耳蜗毛细胞损伤修复能力评估具有一定的临床意义。