袁秋华，石 鑫，梁进仁，万 磊，简友亮，杨 袁，李瑞龙，代小毅，吴文珊

深圳大学化学与环境工程学院，广东深圳 518060

羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)具有晶胞的构造，单胞由10个Ca2+、6个PO43-和2个OH-组成，化学式为Ca10(PO4)6(OH)2．这种结构使HA拥有特殊的稳固能力，其溶液能稳定地接受大量的阴离子和阳离子取代基[1]，形成共掺杂复合结构，使合成材料同时具有多种性能．这其中又以微量元素掺杂功效最为突出，不同的元素掺杂不仅可以改善HA的生物学性能，还能改善其物理学性能[2]，使其能更好地替代人体骨组织[3].由于HA拥有较好的生物相容性，所以植入人体作为骨替代材料时，更利于人体自身的骨传导和骨细胞的附着和增殖[4]．因此，在更换、修复受损或受伤的骨骼临床应用方面，合成羟基磷灰石复合材料具有广泛的应用前景[5]．但与人体自然形成的骨骼相比，HA材料仍有明显的缺陷，如韧性不足、脆性较大．而石墨烯(graphene, GP)的添加能大大增加HA的韧性，同时能保留HA自身的各种良好特性[6]．

含铈(Ce)的化合物具有一定的抗菌性[7]，因此铈是某些抗菌药物不可缺少的元素．另外，Ce元素具有很好的抗氧化活性，可用于治疗如辐射与老化引起的细胞衰老或细胞死亡[8]．而Ce掺杂HA主要应用于骨治疗领域，源于Ce的抗菌性和抗氧化性：抗菌性可以防止细菌的增殖从而保证骨细胞更好地繁殖；抗氧化性可以减缓骨细胞的衰亡，保证骨细胞有良好的细胞周期，加快骨组织再生，提高治疗效率[9-10]．

锌(Zn)元素存在于人体的大部分组织中，参与人体的大多数生化反应，其中酶的活性、蛋白质的合成、细胞膜的结构和细胞的代谢都离不开Zn．由于Zn能促进骨细胞代谢，加快HA的沉积效率，且能抑制破骨细胞的骨吸收，对新骨组织的生成有一定协助作用，因此，Zn掺杂HA可应用于医疗领域[11]．Zn还具有优异的抗菌性，同样可以防止材料植入人体时引起的感染[12]；另外，基于其无毒性与成本的考虑，Zn2+掺杂HA主要用于替代银掺杂的HA，由于HA在体内沉积时，材料中含有的银及其化合物也将释放至人体中，而银元素具有一定毒性，对人体会造成一定的损害，且银的成本比锌昂贵．所以利用Zn代替银掺杂HA，具备较好的性价比．

GP作为一种热门的碳纳米材料，在与不同功能纳米材料(贵金属、金属化合物、碳材料和高分子材料等)复合时，具有独特的光学、机械、电学、热力学、化学和催化性能[13]．且GP在生物医学应用如生物传感器[14]和药物递送[15]方面同样具有优越的生物相容性和生物稳定性，HA-GP复合材料也显示出优越的机械特性和生物活性[16]．另外，GP的可大规模加工性和生物相容性进一步促进了其在医用材料方向的应用[17]．

将Ce、Zn共掺杂HA应用于骨修复领域，可以在体内组织中进行功能互补，彼此间协同作用可进一步增强抗菌性能，同时对骨细胞代谢和再生有更好的促进作用．基于此，本研究通过一锅水热法制备Ce-Zn共掺杂的HA-GP复合粉体材料，并借助相关技术手段对其进行表征分析，同时对复合材料的抗菌等相关性能进行研究探讨．

1 实 验

1.1 试 剂

磷酸氢二钠(Na2HPO4)、 硝酸锌(Zn(NO3)2)、 四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)和硝酸铈(Ce(NO3)3)均购于上海阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇(CH3CH2OH)购自广州市东红化工厂；氢氧化钠(NaOH)购自天津百世化工有限公司．以上试剂均为分析纯．石墨烯购自湖南丰化材料发展有限公司；大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)菌种购自宇德立生物有限公司；固体琼脂培养基、营养肉汤培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司．

1.2 铈、锌共掺杂HA-GP复合材料的制备

采用一锅水热合成法制备Ce、Zn共掺杂HA-GP 复合材料(Ce-Zn-HA-GP)， 具体操作步骤为：① 以Ca(NO3)2·4H2O和Na2HPO4为原料，按摩尔比n(Ca+Ce+Zn)∶n(P)=1.67∶1.00制备溶液，并按不同比例n(Ca)∶n(Ce)和n(Ca)∶n(Zn)将Ce(NO3)3和Zn(NO3)2加入到硝酸钙溶液中，同时加入一定质量浓度的GP，采用超声分散．② 在40 ℃水浴、搅拌速度为350 r/min条件下，使用恒流滴定泵将Na2HPO4溶液以2 mL/min的速度滴加到之前的混合液中，并使用1.0 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值维持在11.0左右，搅拌2 h后，将混合物倒入反应釜中置于180 ℃的烘箱中，反应24 h．③ 反应完毕待反应物冷却至室温，用去离子水及无水乙醇洗涤并干燥处理，取烘干物研磨即得到Ce-Zn-HA-GP复合粉体材料．制备获得的共掺杂复合粉体材料中，n(Ce)=n(Zn)， 根据n(Zn+Ce)∶n(Zn+Ce+Ca)分别为0.02、0.05和0.10，将复合材料依次标记为2Ce-Zn-HA-GP、5Ce-Zn-HA-GP和10Ce-Zn-HA-GP．HA合成的化学方程式为

Ca10(PO4)6(OH)2+6H2O

(1)

1.3 测试与表征

使用日本岛津IRAffinity-1型傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared, FTIR)分析仪进行分析，得到振动特征峰组，测试范围为400～4 000 cm-1；通过德国Bruker的(D8-ADVANCE)X射线粉末衍射仪(X-ray diffraction, XRD)对样品进行物相鉴定及晶体结构的分析，扫描范围 2θ∈[5°，60°]； 使用英国(Renishaw)的激光显微共聚焦拉曼光谱仪分析样品的拉曼散射效应及分子结构，采用波长λ=632.8 nm的激光器，其光谱范围是100～6 000 cm-1；使用日本(日立)的SU-70型扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)对样品进行测试，分析其形貌、粒径尺寸和颗粒分布等情况；使用JSM-7822型场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscopy, FESEM)中配有的能谱仪(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDX)分析样品表面所含元素；使用日立JEM-2100型透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)获得样品表面微观形貌图．

1.4 抗菌性能测试

采用E.coli对样品进行抗菌性能测试，通过菌落总数法评估样品的抗菌性能．有关E.coli的培养及抗菌实验的具体操作均按照《微生物学实验(第四版)》[18]要求进行，实验后进行灭菌无害化处理．具体操作步骤如下：

1)分别称取18 g营养肉汤培养基、32 g营养琼脂培养基，各溶于1 000 mL水中搅拌均匀，之后倒入锥形瓶中在高压蒸汽锅中121 ℃灭菌20 min，制成营养肉汤和琼脂平板培养基备用．

2)用移液枪吸取营养肉汤滴入到冻干菌种中，反复吹吸，使菌种融化并与培养液充分接触．移取100 μL融化后的菌悬液加入到装有营养肉汤培养基的试管中，于37 ℃下培养1 d．之后用接种环在琼脂平板培养基上以Z字接种法接种大肠杆菌，再培养1 d；待繁殖到第3代后，取生长良好的菌落接种到营养肉汤中，于37 ℃ 100 r/min在恒温摇床中培养2 h．

3)通过菌落总数法评估样品对大肠杆菌的抗菌性能．称取掺杂不同摩尔比的复合粉体各0.1 g分别加入到100 mL的营养肉汤培养基中，振荡使其均匀混合，再分别加入100 μL生长良好的菌悬液，混合均匀，按体积稀释到10 000倍，得到稀释后的菌液，并将其接种到琼脂培养基上于37 ℃的条件下培养24 h．统计24 h后菌落的数目，通过式(2)计算样品的24 h杀菌率e，

(2)

其中，n0为对照组培养基上菌落的总数；ni为实验组培养基上菌落的总数．

图1 不同摩尔掺杂比Ce-Zn-HA-GP的FTIR谱图Fig.1 FTIR spectra of Ce-Zn-HA-GP with different doping contents

2 结果与讨论

2.1 Ce-Zn-HA-GP的FTIR表征

2.2 Ce-Zn-HA-GP的XRD表征

图2为Ce-Zn-HA-GP复合粉体材料的XRD图谱，通过对比HA的标准卡片可以发现，(211)、(112)和(300)等晶面衍射峰强度较高，峰形清晰，HA的特征峰明显，说明样品存在HA相．图谱中没有其他杂质峰出现，表明Ce和Zn主要通过取代Ca2+的方式进入HA晶格中，没有以其他化合物相的方式存在于复合粉体中．与纯HA的图谱相比，随着Ce和Zn掺杂摩尔分数的增加，HA特征峰的半峰宽逐渐变宽，峰的强度也在减弱，特别是10Ce-Zn-HA-GP粉体中HA的特征峰半峰宽明显变宽，峰形也不够清晰，说明HA无定形相在逐渐增多，结晶相变少．这是因为掺杂离子的半径(Ce3+和Zn2+分别为0.106 nm和0.074 nm)与Ca2+半径(0.100 nm)不同，且Ca2+与Zn2+的半径差更大，所以随着Ce3+和Zn2+进入HA晶格中，其晶格逐渐发生变形，直至遭到破坏，结晶度降低．同样，由于GP含量较低，复合材料的XRD谱图中并没有出现GP的衍射峰．

图2 不同摩尔掺杂比Ce-Zn-HA-GP的XRD谱图 Fig.2 XRD spectra of Ce-Zn-HA-GP with different doping contents

2.3 Ce-Zn-HA-GP的拉曼红外光谱表征

图3 2Ce-Zn-HA-GP、5Ce-Zn-HA-GP、10Ce-Zn-HA-GP以及GP的拉曼图谱Fig.3 Raman spectra of 2Ce-Zn-HA-GP, 5Ce-Zn-HA-GP, 10Ce-Zn-HA-GP and GP

2.4 Ce-Zn-HA-GP的FESEM形貌观察

图4是Ce-Zn-HA-GP的FESEM图．从图4可见，在复合材料2Ce-Zn-HA-GP、5Ce-Zn-HA-GP和10Ce-Zn-HA-GP中均能观察到GP的典型片层结构，Ce-Zn-HA粉体附着在GP的表面．随着Ce、Zn掺杂摩尔分数的增加，可以观察到复合材料表面的晶体无定形相逐渐增多，开始出现团聚现象，GP表面的粉体分布均匀度下降，同XRD表征的结果一致．由于与被替换离子Ca2+半径不同，随着大量Zn2+和Ce3+进入HA晶格中，HA晶体结构发生变形，这对于晶体的生长产生不利影响，也使得HA晶体中无定型相占比逐渐增加，同时随着晶格的变形，晶体的排列也出现了变化，HA晶粒团聚现象增多．

图4 2Ce-Zn-HA-GP、5Ce-Zn-HA-GP和10Ce-Zn-HA-GP的FESEM图Fig.4 FESEM images of 2Ce-Zn-HA-GP, 5Ce-Zn-HA-GP, and 10Ce-Zn-HA-GP

2.5 Ce-Zn-HA-GP的EDX表征

图5及表1分别为合成的Ce-Zn-HA-GP复合材料的EDX图及相对应表面元素种类与含量．从图5可见，所有复合材料中除了含有Ca、P、O(HA带入)和C(GP带入)外，还检测出Ce和Zn，结合XRD分析可以推断，Ce3+和Zn2+不是以生成混合物的方式存在，而是通过替代Ca2+的方式掺入HA晶格中．另外，由EDX结果中元素的丰度可求得，所有复合材料中钙磷比n(Ca)∶n(P)均介于1.60～1.70，与纯HA钙磷比的理论值1.67相近[21]，合成的Ce-Zn-HA-GP粉体依旧保持HA的晶体结构及化学计量比，而且掺杂元素的摩尔分数大体接近理论值(0.02、0.05和0.10)．同时随着Ce摩尔分数x(Ce)和Zn摩尔分数x(Zn)的增加，n(Ce+Zn+Ca)∶n(P)逐渐变大， HA的晶体结构也随之发生变化，晶格缺陷增多．

2.6 Ce-Zn-HA-GP的TEM形貌观察

图6为Ce-Zn-HA-GP的TEM图．由图6可见，GP在TEM图像中呈薄纱状，表面比较光滑．当Ce和Zn掺杂摩尔分数较低时，HA呈棒状晶粒均匀分布在GP的片层结构上．当Ce和Zn掺杂摩尔分数提高时，晶粒出现团聚，分散均匀度逐渐降低，在Ce和Zn掺杂摩尔分数达到0.10时，团聚现象明显，晶粒间的边界逐渐模糊，晶粒的分布也很不均匀，导致复合材料的TEM图像变得相对模糊，须仔细辨认．

2.7 抗菌性能测试

复合材料的抗菌性能测试结果如图7．由图7可见，3种Ce-Zn-HA-GP复合材料粉体均具有较强的抑菌性，且随Ce与Zn掺杂摩尔分数的增加复合粉体的抗菌性能逐渐提高．通过式(2)计算得到，2Ce-Zn-HA-GP的杀菌率为67.1%，而掺杂摩尔分数达到5%时，粉体的杀菌率为88.6%，有明显增强；当Ce和Zn掺杂摩尔分数达到10%时，复合材料未分体的杀菌率达93.2%．表明Ce3+和Zn2+的掺入，极大地提升了Ce-Zn-HA-GP粉体的抗菌活性．

图5 Ce-Zn-HA-GP粉体的EDX图Fig.5 EDX images of Ce-Zn-HA-GP powders

表1 Ce-Zn-HA-GP粉体元素的相对含量

图6 不同摩尔掺杂比Ce-Zn-HA-GP粉体的TEM图Fig.6 TEM images of Ce-Zn-HA-GP powders with different doping levels

图7 Ce-Zn-HA-GP粉体抗菌效果Fig.7 Graph of antibacterial effect of Ce-Zn-HA-GP powders

结 语

通过一锅水热法成功合成了不同摩尔掺杂比的Ce、Zn共掺杂HA-GP复合粉体材料Ce-Zn-HA-GP，利用FTIR、XRD、拉曼红外光谱、FESEM、EDX及TEM等测试手段对样品进行表征分析．结果表明，一锅水热法可成功合成不同掺杂比的Ce-Zn-HA-GP复合材料，该工艺方法较为简单，合成效率较高，所需设备也不复杂，符合成本、产量和效率之间的最优化原则；Ce、Zn均未在复合材料中形成间隙杂质相，两种元素以离子形式替代Ca2+进入晶体晶格；由于Ce3+、Zn2+与Ca2+半径不同，随着Ce、Zn掺杂摩尔分数的增加，HA晶格缺陷增多，晶体结构也随之发生变化，导致复合材料中无定形相逐渐出现，当Ce和Zn掺杂摩尔分数达到0.10时，团聚现象明显增多，GP表面的粉体分布均匀度大幅度下降．通过抗菌性能测试表明，Ce3+和Zn2+的引入，在很大程度上提高了复合材料的抗菌性.当Ce和Zn掺杂摩尔分数增加到10%时，复合材料的杀菌率达到93.2%．该研究表明，Ce和Zn共掺杂的复合材料Ce-Zn-HA-GP有着良好的抗菌应用价值.