杨丽亚，刘彩玉

（恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北恩施445000）

非黑色素瘤皮肤癌（Nom-melanoma skin cancer） 是导致人类死亡的主要原因之一，包括鳞状细胞癌和基底细胞癌[1-2]。根据统计调查发现，超过20%的人在一生中可能会患上皮肤癌，并且近十年来其发病率呈升高的趋势[3]。目前，皮肤癌的标准治疗方案包括手术、放疗和化疗，晚期皮肤癌患者预后并不理想[4]。因此，开发治疗皮肤癌的新型高效药物是很有意义的。

磷脂醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素的哺乳动物靶点（PI3K/AKT/mTOR）级联信号传导是研究较多的致癌/抗癌途径[5]。PI3K/AKT/mTOR途径的过度激活在皮肤癌和其他肿瘤生物学行为中都有发现，包括细胞存活、增殖、迁移、细胞凋亡、肿瘤转移、血管生成和转化[6-7]。于是，PI3K/AKT/mTOR信号系统是治疗及预防皮肤癌的一个潜在靶点，开发的一些PI3K/AKT/mTOR抑制剂已在临床前或临床肿瘤治疗中进行了研究[8]。

最新研究开发出的一种新型的、有效的、口服生物可用的PI3K/mTOR双向抑制剂（LY3023414），其还能阻断AKT信号传导[9]。本研究观察LY3023414对体外培养的人皮肤基底细胞癌细胞生长的影响及其作用机制。

1 材料及方法

1.1 一般资料

1.1.1 主要试剂 LY3023414购买于北京AdooQ Bioscience公司，其他PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂（纳巴霉素、OSI-027、MK-2206和渥曼青霉素）购买于上海 Selleck公司，Annexin V-FITC/PI和CCK8试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所，兔anti-Cleaved-caspase-3、兔 anti-CleavedPARP、兔 antip-P85（Y458）、兔 anti-P85、兔 anti-p-AKT（S473 and T308）、兔 anti-AKT、兔 anti-p-S6K（T389）、兔anti-S6K和兔anti-β-actin购自英国Abcam公司，Caspase-glot-3/9活性测定试剂盒购买于美国Promega公司，酶联免疫吸附试验（ELISA）单链DNA（ss DNA）试剂盒购买于武汉华美生物有限公司。

1.1.2 主要仪器 CY78-5型单人超净台（苏州华新空调净化有限公司）；细胞培养箱（上海医用分析仪器厂）；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪（DX540，美国）；SDS-PAGE凝胶电泳仪（型号DYCZ-24DN，北京六一仪器厂）；成像系统（BIO-RAD，美国），FACS-Calibur流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.1.3 细胞培养及药物干预 TE354T细胞、原代Pri can-1细胞、原代Pri can-2细胞、人皮肤黑素细胞、皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞由武汉巴菲尔生物有限公司提供，且均采用含10%胎牛血清的高糖培养基（DMEM）高糖培养液，培养箱条件设置为5% CO2、4℃恒温，显微镜观察细胞生长至90%左右时，便可开始传代培养。LY3023414（5、10、50、100、200nmol/L）分别处理人皮肤基底细胞（TE354T）细胞24h、48h及72h后，再进行后续实验。100 nmol/L的LY3023414处理原代Pri can-1细胞、原代Pri can-2细胞、人皮肤黑素细胞、皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞48 h后，再进行后续实验。

1.2 方法

1.2.1 CCK8实验 将对数期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，经LY3023414处理后，弃去旧培养液，每孔加入100μL含10μL的CCK8试剂的DMEM培养液，放入培养箱中继续孵育1.5h，在酶标仪450 nm波长处检测细胞吸光度OD值，并计算细胞相对存活率。计算公式如下：细胞相对存活率（%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.2 Caspase活性实验 将对数期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后经LY3023414处理细胞48 h后，Caspase-glot-3/9活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性，采用酶标仪在405 nm处测定其吸光度值。

1.2.3 ssDNA凋亡ELISA 将对数期细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，培养过夜，然后加入LY3023414处理细胞48 h后，收集细胞裂解，取上清液，ss DNA酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒分析裂解液中ss DNA水平，采用酶标仪在405nm处测定其吸光度值。

1.2.4 流式细胞术实验 将对数期细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞，培养24h，然后加入100nmol/L的LY3023414处理细胞48 h后，弃去旧培养液，消化收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后，分别加入Annexin-V FITC和PI处理细胞（按照试剂盒操作说明书进行），最后用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。

1.2.5 免疫印迹实验 收集各组细胞，PBS清洗细胞2次，每孔加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集细胞裂解液，4℃条件下12000r/min（离心半径10 cm）离心12 min，收集上清。二辛喹酸（BCA）法检测了上清中总蛋白浓度，每孔上样40 μg进行电泳分离，恒压70 V，电泳3 h。然后在恒流275 mA条件下电转70 min，5%脱脂牛奶封闭1 h后，将目的条带放入对应的一抗溶液（稀释比1∶1000）中，4℃摇床孵育过夜。洗膜缓冲液（TBST）洗膜3次，10 min/次，再把条带放入盛二抗（稀释比 1∶3 000）的平皿中室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入4mL的增强型化学发光显影液（ECL）显色3 min，凝胶成像系统曝光。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY3023414抑制TE354T细胞增殖 采用不同浓度 LY3023414（5～200 nmol/L）分别处理 TE354T细胞24 h、48 h及72 h后，结果提示LY3023414处理细胞48 h后对TE354T细胞的增殖活性有明显的抑制作用，且呈现出浓度和时间依赖性（P<0.05）。LY3023414干预TE354T细胞48 h后，其半数抑制率（IC50）大约在100 nmol/L，见图1A。细胞克隆实验发现，LY3023414呈浓度依赖性的减少TE354T细胞克隆数（P<0.05），见图1B。BrdU ELISA实验结果提示，LY3023414呈浓度依赖性的降低TE354T细胞的吸光度（P<0.05），见图1C。细胞周期考察发现，LY3023414处理TE354T细胞48 h，G0-G1期细胞数明显增多，而S期和G2-M期细胞数明显减少（P<0.05），见图 1D。

实验进一步采用原代人皮肤基底细胞癌细胞（Prican-1和Prican-2）为研究对象，发现100 nmol/L的LY3023414处理Pri can-1和Pri can-2细胞48 h后，能够明显抑制细胞的增殖能力（P<0.05），见图1E。另外，采用100 nmol/L的LY3023414处理皮肤黑素细胞、皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞48 h后，发现其对上述3种细胞增殖活性没有明显影响（P<0.05），见图 1F。

图1 LY3023414降低TE354T细胞增殖活性

2.2 LY3023414诱导TE354T细胞凋亡 进一步观察LY3023414对TE354T细胞凋亡的影响，结果显示LY3023414呈剂量依赖性的诱导TE354T细胞中凋亡相关蛋白Caspase-9和Caspase-3的活性，见图2A；同时LY3023414呈剂量依赖性的诱导促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表达，见图2B。进一步对细胞凋亡标志物单链DNA（ss DAN）的水平检测，提示LY3023414呈剂量依赖性的增高ss DAN的含量，见图2C。实验还采用流式细胞术实验分析LY3023414对TE354T细胞凋亡的影响，发现100 nmol/L的LY3023414处理细胞48 h后，能明显诱导细胞凋亡的发生，见图2D、E。

100 nmol/L的LY3023414处理Pri can-1和Pri can-2细胞48h后，能够明显诱导细胞凋亡（P<0.05），见图2F。另外，采用100 nmol/L的LY3023414处理皮肤黑素细胞、皮肤角质形成细胞和皮肤成纤维细胞48 h后，发现其对上述3种细胞中ss DAN水平没有明显影响（P<0.05），见图2G。

图2 LY3023414诱导TE354T细胞凋亡

2.3 LY3023414对PI3K/AKT/mTOR信号转导的影响 LY3023414是PI3K/AKT/mTOR信号通路潜在的、新的抑制剂，于是进一步观察PI3K/AKT/mTOR信号传导活性。100 nmol/L的LY3023414处理TE354T和Pri can-1细胞48 h后，PI3K/AKT/mTOR信号通路靶蛋白 P85（Y458）、AKT（S473 和 T308）和S6K（T389）的磷酸化水平均降低，而 P85、AKT1/2和S6K1表达水平没有发生变化，见图3A、B。然而，皮肤成纤维细胞中P85、AKT1/2和S6K1表达水平相对较低，而且 LY3023414 对 P85（Y458）、AKT（S473 和T308）和S6K（T389）的磷酸化水平也没有明显影响，见图3C。

图3 LY3023414对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

2.4 不同PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对TE354T细胞增殖的影响 实验进一步比较LY3023414（LY）和其他PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂，包括雷帕霉素（Rap）、mTOR 激酶抑制剂 OSI-027（OSI）、AKT特异性抑制剂MK-2206（MK）和渥曼青霉素（WT），抗TE354T细胞增殖的活性。LY3023414相比于同浓度的其他抑制剂更能明显抑制TE354T细胞的增殖活性，见图4A。同样的，LY3023414相比于同浓度的其他抑制剂更能明显增高TE354T细胞凋亡标志物ss DNA的水平，见图4B。

图4 PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂降低TE354T细胞增殖活性

3 讨论

临床研究表明，人皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌组织中PI3K/AKT信号通路过度激活，提示该信号系统是导致皮肤癌发病的机制[10-11]。已有研究证实，人皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中p-AKT免疫荧光结果为阳性，并且p-AKT表达水平在鳞状细胞癌中相对于基底细胞癌更高[1-2]。因此，PI3K/AKT信号抑制是治疗皮肤癌的一个潜在靶点。本文研究中，实验证实了新的PI3K/AKT/mTOR抑制剂LY3023414对TE354T细胞系、原代人皮肤基底细胞癌细胞有不良反应。LY3023414诱导TE354T细胞停滞在G0/G1-S期，进而抑制细胞增殖。与此同时，LY3023414通过激活caspase-3/9活性诱导TE354T细胞凋亡。

mTOR位于PI3K/AKT/mTOR信号通路的中心位置，已发现至少2种mTOR复合体（mTORC1和mTORC2）[13]。本文研究发现PI3K抑制剂LY3023414对人皮肤基底细胞癌TE354T细胞的药物毒性作用相比于mTORC1抑制剂纳巴霉素、OSI和WT更强。可能的解释是抑制剂纳巴霉素和OSI-027只能仅仅抑制mTOR介导的信号传导，而LY3023414能阻断整个PI3K/AKT/mTOR信号通路。更有趣的是，LY3023414素对TE354T细胞增殖的抑制作用也明显优于WT，可能是由于LY3023414同时干扰了其他致癌信号传导的活化，比如GSK-3β/CREB信号通路[15]。本文结果还提示LY3023414可以降低PI3K/AKT/mTOR 信号通路靶蛋白P85（Y458）、AKT（S473和 T308）和 S6K（T389）的磷酸化水平，进而诱导了TE354T细胞的早期和晚期凋亡，还降低了促凋亡蛋白Cleaved casapase-3和Cleaved PARP的表达，并且呈浓度依赖性的促使凋亡标志物ssDNA的水平。

综上所述，LY3023414通过靶向抑制 PI3K/AKT/mTOR信号通路活化，降低了人皮肤基底细胞癌TE354T细胞的增殖活力，并诱导了其凋亡。研究结果为LY3023414临床上治疗人皮肤基底细胞癌提供合理的依据。