贺 星， 刘 卫， 朱 斌， 严和中， 唐 郡

解放军联勤保障部队第九〇一医院 消化内科，安徽 合肥 230031

应激是指机体稳定的内环境受到外来非特异性的刺激而出现的一种不协调状态[1]，可影响下丘脑-垂体-肾上腺轴和自主神经系统，导致皮质醇水平释放增加[2-3]。应激与肠道疾病，如炎症性肠病、肠易激综合征及其他功能性胃肠疾病密切相关[4-5]。而肠道微生物-脑-肠轴障碍可能是应激导致肠道疾病的重要病理基础[6]，提示应激可通过影响肠道微生态引起肠道症状。但应激如何作用于肠道菌群及其机制研究报道少见。本研究旨在探讨应激对大鼠肠道菌群变化的影响及可能机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取20只雌性SPF级Wistar大鼠为研究对象[7-8]，体质量(160±10)g，购于北京科宇动物养殖中心。大鼠均被安置于独立代谢笼内，平衡饲养3 d。将大鼠随机分为A组与B组，每组各10只。B组大鼠接受急-慢结合应激刺激(7种慢性应激，1种急性应激)，A组大鼠不给予特殊干预。

1.2 实验仪器与设备 光源实时控制仪(乐清彼华电器，型号CHNT)，电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司，型号DH5000)，动脉夹(北京合理科创，型号DMJ-1.6)，水平振荡器(金坛市城西峥嵘实验仪器厂，型号SHZ-82)，大鼠固定器(北京搏贝科技有限公司，型号BB-500GB)。

1.3 研究方法

1.3.1 应激方法 采用急-慢应激法[9]刺激大鼠，具体包括：夜间连续照明12 h，禁水24 h，45℃闷热的环境中5 min，夹尾1 min，4℃寒冷的环境中3 min，食物剥夺24 h，水平振动(120次/min)40 min。每7 d随机顺序给予一次上述刺激，每连续2 d给予的刺激顺序不能相同，使大鼠无法预知刺激的发生，连续刺激3周，然后休息1周。再给予1 h纸带束缚前肩、前上肢、胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不限制其活动。

1.3.2 大鼠肠道症状检测 采用避水应激法[10]测量大鼠排便量。观察记录1 h排便粒数(干便)或者次数(湿便)。于试验28～31 d连续记录5次数值，取平均值。通过滤纸印记判断湿便次数，记录24 h内大便总次数、湿便次数。于造模30 d记录两组大鼠湿便率。

湿便率=湿便数/总便数×100%

1.3.3 HE染色 取大鼠远端结肠组织，按照固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、铺片与捞片、烤片顺序制备石蜡切片[11]。然后使用Olympus光学显微镜放大200倍观察大鼠乙状结肠黏膜上皮结构是否完整，腺体及隐窝结构是否缺失。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链式反应 采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠粪便菌群。大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌目的基因引物如下(5′to 3′)：大肠杆菌上游引物CGGCAACGAGCGCAACCC，下游引物CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC；双歧杆菌上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT；乳酸杆菌上游引物AGCAGTAGGGAATCTTCCA，下游引物CACCGCTACACATGGAG。

1.3.5 蛋白免疫印迹法法检测肠道组织中 claudin-1 按照总蛋白质提取、蛋白浓度测定、配置十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、上样、电泳、转膜、免疫反应、化学发光、检测的顺序进行[12]。claudin-1所需抗体(生产厂家为abcam；规格ab15098)；内参β-actin抗体(生产厂家为abcam；规格ab8227)。

1.3.6 酶联免疫吸附法 离心静脉血及粪便标本，收集后置于-70℃低温冰箱保存。采用酶联免疫吸附法检测试剂盒(Boster，武汉博士德)检测血清白细胞介素(interleukin，IL)-10、IL-8及肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)的水平。操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 两组大鼠肠道症状比较 B组大鼠1 h排便量为(7.14±0.84)次，明显高于A组的(0.82±0.42)次，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B组大鼠湿便率为(12.15%±0.85%)，明显高于A组的0，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 两组大鼠肠道主要菌群计数比较 B组大鼠双歧杆菌、乳酸杆菌计数低于A组，大肠杆菌计数高于A组，两组比较，差异有统计学意(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠肠道主要菌群计数比较

2.3 两组大鼠血清炎症因子水平比较 B组IL-8、TNF-α高于A组， IL-10低于A组，两组比较，差异有统计学意(P<0.05)。见表2。

2.4 两组大鼠肠道组织claudin-1蛋白表达比较 B组claudin-1蛋白表达低于A组，两组比较，差异有统计学意(P<0.05)。见图1。

2.5 两组大鼠结肠黏膜结构比较 A组大鼠肠上皮完整，腺体正常，排列整齐，隐窝结构存在。部分B组大鼠出现上皮变性、坏死，隐窝结构消失，但是病变相对局限。见图2。

3 讨论

临床中，压力事件可引起或加重腹痛等消化道症状，急性压力可导致内脏感觉阈值降低[13]。结合目前肠道微生态与肠道疾病发病的相关研究，考虑应激可能通过脑-肠-微生态轴导致消化道症状的发生[14]，但其具体机制仍未完全确定。本研究采用的应激方法针对大鼠的睡眠、运动、饮食、情绪及感知，并且反复随机刺激，旨在使大鼠产生一种应激与适应的相对平衡状态。通过29 d的作用，大鼠出现了明显的消化道症状，排便次数和湿便比例明显升高，证明了应激刺激在消化道疾病中的作用，与相关研究[15-16]结果一致。为了进一步明确应激对大鼠肠道菌群的影响，本研究分析比较了两组大鼠肠道主要菌群的差异，B组肠道有益菌双歧杆菌及乳酸杆菌低于A组，而大肠杆菌高于A组，提示应激可以改变大鼠肠道菌群的构成和比例。近年来，肠道菌群在肠道疾病发病机理中的作用备受关注[17]。有研究发现，慢性压力可以通过神经内分泌系统导致肠道菌群失调[18-19]，与本研究结果一致，但是具体机制相关研究较少[20]。

表2 两组大鼠血清炎症因子水平比较

图1 免疫印迹法检测大鼠claudin-1蛋白表达

图2 两组大鼠结肠黏膜显微结构(a.B组大鼠结肠黏膜结构；b.A组大鼠结肠黏膜结构；HE×200)

本研究发现，应激刺激后的大鼠促炎因子IL-8、TNF-α明显高于A组，抑炎因子IL-10低于A组，提示应激可以导致大鼠出现炎性反应，其原因可能是应激因素通过激活促肾上腺皮质激素释放因子系统，作用于肥大细胞，产生促炎因子，导致肠道局部炎性反应[21]。本研究对大鼠肠道黏膜微观结构进行观察发现，B组大鼠部分肠道黏膜出现上皮变性、坏死，部分结构消失，在大鼠肠道黏膜没有接受直接理化刺激的前提下，考虑该变化为炎性反应造成。为了明确局部炎性反应对大鼠肠黏膜屏障的影响，本研究分析了肠道组织紧密连接蛋白claudin-1[22]，claudin-1可反映肠黏膜的完整性[23]，结果发现，B组大鼠claudin-1染色明显浅于A组大鼠，提示B组大鼠肠道完整性受到破坏，肠黏膜屏障及肠黏膜完整性破坏，影响肠道菌群的定植环境，从而导致菌群失调。

综上所述，应激因素可以通过影响肠道菌群的种类和比例从而产生消化道症状，其机制可能与应激导致的炎性反应破坏肠黏膜屏障及肠黏膜完整性相关。