李 坚 梁 茉 郭焱雄 胡军祖

(1 湖南省郴州市第一人民医院南院急诊科，郴州市 423000，电子邮箱：11830027@qq.com；2 桂林医学院附属医院骨科，广西桂林市 541000)

根性神经痛是指脊神经根受到各种有害性刺激而引起的疼痛，是腰椎间盘突出症中最常见的症状，严重影响患者的生活质量[1]。根性神经痛发病率较高，其发病机制与治疗仍存在很大的争论。以往的观点认为机械性压迫是导致神经根疼痛的最主要因素，但近年来有研究表明自身免疫反应和相关炎症介质是导致神经根疼痛的关键因素[2-3]，但其引起的神经根损伤的具体机制仍有待进一步阐明。本研究通过检测非压迫性椎间盘髓核突出导致神经根损伤大鼠血清中白细胞介素(interleukin，IL)-17、IL-23的表达水平，探讨IL-23/IL-17炎症轴在神经损伤中的作用，为根性神经痛的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠48只购自桂林医学院动物实验中心[动物合格证号： SCXK (桂)2013-0001]，10月龄，体重在300～350 g之间，并饲养于无特定病原体级环境中，同组每2只大鼠饲养于一个钢丝笼中，室温度为 22℃～26℃，每日早晨8:00至晚20:00开灯，晚20:00至次日8:00熄灯，给予充足的食物和水。大鼠IL-17 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒、IL-23 ELISA试剂盒均购于Santa Cruz Biotechnology公司(批号：A1324、A1316)。

1.2 模型建立、分组与处理 采用随机数字表法将48只大鼠分为实验组与对照组，每组24只。参考文献[4]的方法进行动物造模：采用7%水合氯醛(1.5 mL/只)腹腔内注射后将大鼠固定于动物手术台上，常规备皮、消毒;以L4～5椎间隙为中心，做约长2 cm的后正中切口，显露L4～5关节突关节及横突，小型咬骨钳咬除L4～5右侧关节突及椎板，显露L4～5神经根；消毒实验组大鼠尾，距根部1 cm处切断，切开尾椎间盘，取4～5个椎间盘髓核组织，放置在L4～5神经根周围，但不压迫神经根，消毒后缝合，制作成非压迫性椎间盘髓核突出的动物模型。对照组采用同样的手术方法造模，但神经根旁不放置髓核组织。

1.3 检测指标 分别于术后1周、3周、5周，每组采用随机数字表法选取8只大鼠，检测大鼠的右后肢疼痛缩爪阈值及血清IL-17、IL-23水平，并观察大鼠腰椎神经根形态学变化。(1)参考文献[4]中的方法检测大鼠右后肢疼痛缩爪阈值：将大鼠右后肢外露并固定，待大鼠安静后，用自制的痛阈测量器检测大鼠右后肢缩爪阈值。测量器由1个5 mL注射器和水银血压计改装而成，将注射器的内芯做成活塞，20 mL注射器的针尖磨钝并粘在活塞上，注射器与血压计用硅胶管相连。将磨钝的注射器针头置于大鼠右后爪的第2～3跖骨之间，捏皮囊给血压计充气，将大鼠出现尖叫或缩爪时的血压计读数作为疼痛缩爪阈值，间隔至少20 min后再次测量1次，取平均值。(2)检测血清IL-17、IL-23水平：抽取大鼠腹腔静脉血2 mL，置于血清分离管中在室温放置2 h，然后室温下以2 000 r/min离心20 min，取上清并置于-20℃保存；采用ELISA法检测大鼠血清中IL-23、IL-17的表达水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。(3)观察大鼠腰椎神经根形态学变化：将大鼠脱臼处死后显露其腰神经根，切取1 cm L4～5神经根标本，然后浸泡在福尔马林液中固定1周；然后将神经根包埋在石蜡中进行切片，厚度为10 μm；将切片脱蜡并进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色；常规脱水、透明、树胶封片，在显微镜下观察大鼠腰椎神经根形态学变化并照相保存。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

实验组大鼠术后逐渐出现易激惹、多动等现象，术后3周时最为明显，术后5周时恢复正常；而对照组大鼠术后未出现易激惹、多动等现象。术后1周、3周时，实验组大鼠右后肢疼痛缩爪阈值均低于对照组，血清IL-23与IL-17水平均高于对照组(均P<0.05)；而术后5周时，两组大鼠的右后肢缩爪阈值及血清IL-23、IL-17水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1～3。

表1 两组大鼠右后肢疼痛缩爪阈值的比较(x±s，mmHg)

表2 两组大鼠血清IL-17及IL-23水平的比较(x±s，pg/mL)

HE染色结果显示：对照组大鼠术后神经纤维排列规律，大小基本一致，髓鞘完整，呈红色，位于轴突周围，未发现变性改变和炎症细胞浸润。术后1周时实验组大鼠神经根纵切面可见神经纤维髓鞘部分崩解并呈空泡病变，可见炎症细胞浸润；术后3周时其神经根损伤加重，神经纤维排列不规律，大小不一，髓鞘崩解，空泡样病变严重；术后5周时其神经根基本恢复正常。见图1。

图1 造模后两组大鼠腰椎神经根形态学变化(HE染色，×200)注：图A～C分别为对照组术后1周、3周、5周神经根纵切面，图D～F分别为实验组术后1周、3周、5周神经根纵切面。

3 讨 论

有研究表明，椎间盘髓核是一种自身抗原，在暴露或纤维环损伤后，淋巴细胞会在局部椎间盘组织中聚集[5]。Kimura等[6]研究发现，椎间盘髓核可导致神经根损伤。背根神经节是躯体感觉的初级传入神经元，其周围分布着大量的痛觉感受器，当机体组织损伤或发生炎症时，受损细胞释放的内源性致痛物质能激活痛觉感受器，或使其阈值降低。Kato等[7]报告，5-羟色胺可以使大鼠出现明显的痛觉过敏。动物实验证实，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)可以使大鼠的下肢出现明显的痛觉过敏，背根神经节出现明显的形态学变化[8]。本研究结果显示，术后1周、3周实验组大鼠的腰椎神经根纵切面可见神经根损伤，术后5周时其神经根形态基本恢复正常，表明髓核组织具有自身免疫源性，显露后可激发免疫炎症反应导致神经根损伤。因此，进一步研究免疫炎症反应对神经根损伤的具体作用机制意义重大。

IL-23属于IL-12超家族中的一员，是由P19和P40亚单位以共价二硫键结合组成的异二聚体分子。Oppmann等[9]于2000年首次报告IL-23是一种新的促炎症细胞因子。近年来许多研究关注IL-23的生物学功能及其在免疫相关性疾病中的潜在治疗作用，例如感染、炎症、自身免疫和肿瘤等领域。Jiang等[10]研究发现，腰椎间盘突出症患者的髓核组织中IL-23表达增高，且在纤维环破裂髓核组织完全暴露者中IL-23的表达进一步增高，提示IL-23参与椎间盘突出的发病过程。IL-17是一种强烈的促炎症细胞因子，主要由Th17/调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)分泌，有极强大的募集和激活嗜中性粒细胞的能力，能诱导活化T淋巴细胞和刺激巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞产生多种细胞因子，如IL-1、IL- 6、TNF-α、金属蛋白酶和化学增活素等[11]。此外，IL-17与TNF-α等炎症因子具有协同作用，可以放大并加强其致炎效应[12]。IL-23主要是由活化的树突状细胞和巨噬细胞分泌，它可以诱导CD4+T淋巴细胞分化成Th17/Treg，同时促进Th17增殖并维持其存活[13-14]，此外其可促进IL-17的产生，且不需要γσ受体T淋巴细胞的参与[15]。因此，IL-23和IL-17通过Th17形成新的炎症轴，在许多炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用，如类风湿性关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎和炎症性肠病等[16]。Tian等[17]的研究表明，IL-17通过促进自身免疫炎症、趋化作用和血管生成作用参与椎间盘突出症的发生。Cauvi等[18]研究发现，过度刺激IL-23/IL-17通路可能对多菌性脓毒症所致的肺部炎症进展产生不利影响，而恢复IL-23和IL-17表达水平之间的平衡可能有刊于败血症的治疗。

本研究建立了非压迫性椎间盘髓核突出大鼠模型，检测其血清中IL-17、IL-23的表达水平，结果显示，实验组大鼠术后1周、3这周时血清中IL-17、IL-23的表达水平均高于对照组，右后肢疼痛缩爪阈值均低于对照组(均P<0.05)；HE染色结果提示，实验组大鼠术后1周、3周时，神经纤维排列不规律，大小不一，髓鞘崩解，呈空泡样病变，炎症细胞入侵，而对照组大鼠未见明显异常。以上结果说明 IL-17、IL-23在椎间盘髓核突出早期所致的免疫炎症反应发挥着重要作用。在椎间盘突出早期，隐蔽的髓核组织暴露在自身免疫系统中，可激活免疫反应，促使IL-17、IL-23的表达水平升高而引起免疫炎症反应，从而损伤神经根，最终导致临床症状的出现。本研究结果显示，术后5周时，两组大鼠的血清IL-23与IL-17的表达水平，以及右后肢疼痛缩爪阈值比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，且神经根HE染色提示实验组大鼠神经根基本恢复正常，这可能是由于免疫系统具有负调控机制。

综上所述，非压迫性椎间盘髓核突出导致的神经根损伤大鼠模型血清中有IL-17、IL-23的表达水平增高，IL-23/IL-17炎症轴在可能在根性神经根痛发病过程起关键作用，其可能成为椎间盘突出症所致腰腿痛的一个新治疗靶点。但本研究存在一定的局限性，如未检测神经根中IL-17、IL-23的表达水平，也没有进一步研究其他细胞因子(如IL-1、IL-6等)对非压迫性椎间盘髓核突出导致的神经根损伤的影响，这些细胞因子在椎间盘突出症发病过程的作用有待研究。