王波 周兰英 夏华梅

摘要：探究大白杜鹃花粉萌发所需的营养液浓度组合，为大白杜鹃的资源保存及杂交育种提供科学依据。以大白杜鹃新鲜花粉为试验材料，利用单因子试验比较固体培养基中不同浓度的蔗糖、硼酸、Ca2+对其萌发的影响，在此基础上进行正交试验，探讨大白杜鹃花粉萌发的最佳蔗糖、硼酸、Ca2+浓度组合。结果表明，在一定质量浓度范围内，蔗糖、硼酸、Ca2+对大白杜鹃花粉萌发均起到促进作用，但是超过一定质量浓度时则起抑制作用，最适浓度分别为10%、0005%、0.002%。蔗糖、硼酸和Ca2+这3个因素的综合作用对大白杜鹃花粉萌发有显著影响，大白杜鹃花粉的最适培养基为10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%Ca2+。

关键词：大白杜鹃;花粉;萌发;培养基

大白杜鹃（Rhododendron decorum Franch.），别称大白花杜鹃，是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron L.）木本植物，在我国主要分布在四川、云南、贵州、西藏等地，在四川省会理县生长于龙肘山海拔1 900～2 100 m处，种群成片分布。大白杜鹃花簇多花，形如绣球，色泽艳丽;是杜鹃花中少有的香花品种，具有很高的观赏价值;分布广泛、海拔较低，是香花育种的理想亲本。张敬丽等研究发现，马缨花（Rhododendron delavayi Franch.）与大白花杜鹃进行杂交后，杂交种能够结出可育的种子[1]。此外，大白杜鹃还可供食用和药用[2-3]，开发利用前景广阔。但是，人为干预使其生境遭到严重破坏，资源日趋受到威胁，环境干旱使野生杜鹃结实率降低[4]，大白杜鹃物种资源的保存迫在眉睫。

目前，国内外对大白杜鹃的研究主要集中在生态分布、染色质组成[5]、营养成分[2]和组织培养[6]等方面，有关大白杜鹃花粉的储存及其生活力、萌发条件的研究未见报道。目前已有少数其他杜鹃种花粉的研究，如徐芬芬等对毛杜鹃（Rhododendron pulchrum）花粉离体萌发特性的研究发现，毛杜鹃花粉萌发的最适硼酸质量浓度为10 mg/L，培养7 h后花粉萌发情况稳定[7]。李玉萍等以满山红、映山红、马银花、锦绣杜鹃的新鲜花粉为试验材料，测定不同液体培养基和储藏方法下的花粉萌发力，发现杜鹃花花粉的适宜培养基配方为100 g/L蔗糖+20 mg/L 硼酸+20 mg/L CaCl2[8]。目前，关于其他植物花粉萌发的研究非常多，不同植物花粉萌发要求的最适培养基组合和浓度不同，但适量的蔗糖、硼酸、CaCl2会提高多数植物花粉的萌发率。目前，关于大白杜鹃花粉萌发的研究未见报道，本试验用蔗糖、硼酸及CaCl2 3个因素组成的固体培养基研究大白杜鹃花粉的萌发力，旨在找出适合大白杜鹃花粉萌发的营养液浓度组合，为大白杜鹃的资源保存及杂交育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料于2013年5月9日采自四川省会理县龙肘山海拔1 900～2 100 m处。选择20株盛花期大白杜鹃植株上即将开放的100朵花，用湿毛巾包裹后放入装有冰块的洁净纸盒内冷藏并迅速带回实验室，任其花药自然开裂，收集花粉，并将花粉充分混匀，避免个体植株花药不同引起的花粉生活力差异。将收集的花粉装入花粉瓶中，于 4 ℃ 低温冷藏。

1.2 培养基配方和制作方法

单因素试验中各因素浓度水平[9-10]如表1所示，以同样浓度的空白培养基作为对照。在进行单因素试验后，总结分析各因素浓度对花粉萌发的影响，并在此基础上进行L16（43）正交试验。按浓度配方配制100 mL溶液，加入搪瓷碗中，煮沸后向其中加入1 g琼脂粉，搅拌至充分溶解，冷却后作为花粉接种用固体培养基。

1.3 花粉培养观测方法

在双孔凹型玻片孔内滴1滴清水以保持湿度，在盖玻片上滴入适量培养基，将花粉均匀播种在培养基上，再将有培养基的一面朝下盖在玻片孔上，每个培养基设5个重复。将玻片放入25 ℃人工培养箱中，在黑暗条件下培养。每隔2 h观测1次，发现花粉萌发后，每隔1 h观测1次，最终从2次测定萌发率基本相同开始测定萌发率。大白杜鹃花粉为四合体，单粒花粉为圆球形[11-12]，在统计花粉萌发数时，只要有1个花粉萌发即视为萌发，以花粉管长度超过花粉直径作为判断萌发的标准。每个玻片观察5个视野，每个视野观察的花粉数不少于30粒，记录花粉的萌发数量，花粉萌发率的计算公式如下：

花粉萌发率=已萌发的花粉粒数/测定的花粉粒总数×100%。

1.4 数据统计分析

用Excel软件进行数据整理，并用SPSS软件对正交试验数据进行单因变量多因素方差分析，若差异显著，则在方差分析的基础上用新复极差法（SSR）进行因素水平间的多重比较。

2 结果与分析

2.1 大白杜鹃花粉萌发的基本情况

将大白杜鹃花粉于25 ℃黑暗条件下处理3 h后，四合體吸水膨大，极面观为三裂球形;6 h后花粉管从宽大的萌发沟内长出，并逐渐增长;10 h后萌发基本趋于稳定，花粉管的长度达到最长。在按试验对照条件处理12 h后，花粉的萌发效果见图1。

2.2 单因素试验中不同浓度蔗糖、硼酸、CaCl2对大白杜鹃花粉萌发的影响

2.2.1 蔗糖对大白杜鹃花粉萌发的影响 由图2可知，不同浓度蔗糖对大白杜鹃花粉萌发有不同程度的影响。当蔗糖浓度为0、2%、5%、10%时，花粉萌发率随着蔗糖浓度的升高而提高，分别为688%、20.77%、54.91%、74.23%，最大萌发率为74.23%;但当蔗糖浓度超过10%以后，花粉萌发率随着蔗糖浓度的增加而下降。综上，大白杜鹃花粉萌发的适宜蔗糖浓度为10%。

2.2.2 硼酸对大白杜鹃花粉萌发的影响 由图3可知，不同浓度硼酸对大白杜鹃花粉萌发有不同程度的影响。当硼酸浓度为0～0.005%时，花粉萌发率随着硼酸浓度的升高而提高，最大萌发率为5757%;但当硼酸浓度超过0.005%以后，花粉萌发率随着硼酸浓度的增加而下降。综上，大白杜鹃花粉萌发的适宜硼酸浓度为0.005%。

2.2.3 CaCl2对大白杜鹃花粉萌发的影响 由图4可知，不同浓度CaCl2对大白杜鹃花粉萌发有不同程度的影响。当CaCl2浓度为0～0.002%时，花粉萌发率随着CaCl2浓度的升高而提高，最大萌发率为39.47%; 但当CaCl2浓度超过0.002%以后， 花粉萌发率随着CaCl2浓度的增加而下降。综上，大白杜鹃花粉萌发的适宜CaCl2浓度为0.002%，并且高浓度的CaCl2会明显抑制大白杜鹃的花粉萌发。

2.3 正交试验结果分析

单因素试验结果表明，对照条件下大白杜鹃花粉有少量萌发，表明外源因素不是萌发的必要因素。如表2所示，大白杜鹃花粉在10%蔗糖+0005%硼酸+0.001%CaCl2培养基配方下的萌发率最高，达到86.69%。极差分析结果显示，对花粉萌发率影响的因素排序为蔗糖、硼酸、CaCl2，极差依次为167.74、135.26、58.06，相应的较优水平分别为A3（10%）、B3（0.005%）、C2（0.002%），由较优水平组合而成的最佳培养基配方为10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2，与单因素试验得出的正交试验结果最高的萌发率培养基配方一致。正交试验结果表明，蔗糖、硼酸和CaCl2在一定浓度范围内共同作用时对大白杜鹃花粉的萌发有一定促进作用;大白杜鹃花粉萌发的最适培养基配方为10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002%CaCl2。

3 结论与讨论

很多研究发现，植物花粉离体萌发的影响因素很多，内因包括供体植株基因型、发育时期、花粉生活力等，外因如培养基固液形态、琼脂浓度、培养温度和湿度、光照条件、培养基营养种类和浓度等[13]，其中蔗糖、硼酸及一些矿质元素如外源Ca2+等的参与是比较重要的，是诱导离体花粉萌发的基本条件。在本试验中，对照处理的花粉也具有一定的萌发率，由此或可大胆推测，花粉可能本身就含有少量蔗糖、硼酸及Ca2+。目前已知，细胞壁是植物细胞最大的钙库，用X射线分析钙在花粉粒中的分布结果也显示，多数植物花粉壁上含有少量钙[14]。

一般认为，蔗糖在花粉萌发过程中的作用有2个，一是为花粉萌发和花粉管的生长提供能源和碳源，二是调节培养环境渗透压[15-16]。试验中一定浓度的蔗糖促进大白杜鹃花粉萌发，最适宜的蔗糖浓度为10%，当蔗糖浓度过高时，花粉萌发率开始下降，这与徐芬芬等的研究结果[17]相似。这有可能是因为适当浓度的蔗糖能维持花粉与培养基之间的渗透平衡，而过高的蔗糖浓度则会导致花粉管破裂产生质壁分离现象，从而造成原生质体脱水，抑制花粉萌发生长，降低萌发率[18-19]。

目前许多研究发现，硼作为植物必需的微量元素，在花粉萌发和花粉管伸长中的主要作用是增加糖的吸收、运转和代谢，以增强花粉管壁的可塑性[20]。在离体条件下，补充一定量的外源硼，可以大大提高其花粉萌发率。在本试验中，提高硼酸浓度显著提高了花粉萌发率，当硼酸浓度为0.005%时，大白杜鹃花粉的萌发率最高。

钙离子在生物体的电化学震荡理论中被称为细胞中调节的“第二信使”，钙离子水平受到环境中钙含量和植物自身钙受体的影响，从而引起一系列生长发育过程。在花粉的离体培养过程中，Ca2+可以通过多种途径影响花粉萌发和花粉管的生长，其中涉及细胞骨架的组装、分泌小泡的运输和融合、花粉管顶端的脉冲式生长、花粉管生长方向调控等各个方面[21-24]。许多研究发现，外源钙对花粉萌发和花粉管生长的作用取决于细胞内游离钙的含量，即在细胞内游离钙充足或已充分吸收外源钙时，外源钙对花粉萌发和花粉管生长就可能起抑制作用，反之则起促进作用。本试验中单因素Ca2+浓度明显影响大白杜鹃花粉萌发，表明一定程度的外源钙能促进大白杜鹃花粉萌发和花粉管生长，当Ca2+浓度为0.002%时，花粉萌发率最高，而当Ca2+浓度高于0.005%时，花粉萌发则明显受到抑制，这与周瑞金等的研究结果[25]一致。

通过正交试验，得到大白杜鹃花粉萌发的最适培养基配方是10%蔗糖+0.005%硼酸+0.002% CaCl2，在此条件下花粉萌发率最高，且远超过单因素试验中的最高萌发率。另外，当钙离子为高水平而硼酸为低水平，或钙离子为低水平而硼酸为高水平时，两者表现出负交互作用。原因可能是单因素之间的交互作用促进了花粉萌发，如硼酸可以与蔗糖形成络合物，从而促进果胶物质的合成、糖的吸收，进而更大程度地促进花粉萌发[15]。此外，硼还可能通过影响关键酶活性与Ca2+浓度梯度相关联，影响其花粉管细胞壁的构建与生长[26]。试验结果显示，蔗糖对花粉萌发影响最大，硼酸次之，Ca2+对花粉萌发有促进作用，但影响比硼酸小。钙离子对花粉萌发的影响较硼酸小的结论得到了其他研究者的支持，一般认为花粉细胞内钙离子较多而硼素较少，因而萌发时胞外硼素的影响较胞外钙离子的影响高[27]。

通過花期喷施具有促进花粉萌发和花粉管生长的物质的方法来提高结实率和促进种子发育、膨大是生产上的一项重要措施。本研究结果表明，大白杜鹃花粉萌发的最适培养基组合10%蔗糖+0005%硼酸+0.002%CaCl2可为大白杜鹃杂交育种提供技术上的参考。在花期喷洒蔗糖、硼酸、CaCl2或者其三者组合有助于大白杜鹃结实，而在授粉过程中喷洒含有蔗糖、硼酸、CaCl2的花粉营养液的方法是辅助授粉的较好手段。但在实际生产中，由于营养液对花粉萌发的作用可能还与树龄和温度等其他因素有关，因此营养液的适宜浓度应根据环境条件经试验而定。

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