关晋东，丁 杰，刘晓宇，孙 诚*

(南通大学教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001)

外周神经系统(peripheral nervous system,PNS)在机体内分布广泛且起到介导靶器官与中枢神经系统信号传递的重要作用。轴突的髓鞘化是神经系统传递神经冲动信号，执行其功能的基础保障，髓鞘化过程异常会导致多种疾病的发生[1]。外周神经中执行髓鞘形成这一重要任务由施万细胞完成。外周神经髓鞘形成过程是一个严谨的、由多种转录因子参与调控的复杂生理过程[2]。这些转录因子包括SRY 盒转录因子10(SRY-box transcription factor 10,Sox10)，八聚体结合转录因子6(octamer-binding transcription factor-6,Oct6)，髓鞘早期生长因子20(early growth response-2,Krox20)，髓磷脂蛋白(myelin protein zero,MPZ)等。

G 蛋白耦联胆汁酸受体(G-protein-coupled bile acid receptor 1,GPBAR1，同时也被称为TGR5)，在多种组织和器官中有不同水平的表达，功能多样[3]。有报道[4]指出TGR5 可通过激活环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophsphate,cAMP)-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信号通路调节恶性肿瘤的发生发展过程。6α-乙基-23(S)-甲基胆酸[6 alpha-ethyl-23(S)-methylcholic acid,INT777]是TGR5 特异性激动剂，具有毒性低、效价高等特点。研究[5]发现施万细胞与背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)神经元共培养模型中，二丁酰环腺苷酸(dibutyryl cyclic adenoslne phosphate,dbcAMP)的添加能促进细胞分化，加速髓鞘化进程。本研究旨在通过激动剂INT777 处理原代施万细胞，明确其对外周神经髓鞘化进程的作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生1 d 的SD 大鼠红皮30 只购于南通大学实验动物中心。

1.2 实验试剂 Forsklin,HRG(human Heregulin-1)、dbcAMP、Trizol、ComC(Compound C)均购于MERCK公司，DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清均购于Gibco 公司，SuperScript IV/RT-PCR Kit、Applied Biosystem SYBR Green Mix 购于Thermo Fisher 公司，SDS-PAGE 凝胶购于碧云天生物公司，细胞裂解液RIPA，5×SDS-PAGE 电泳缓冲液、5×SDS-PAGE Loading buffer、10×Trans buffer、10×三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris buffered saline tween,TBST)均在实验室自配。

1.3 实验方法

1.3.1 施万细胞培养 施万细胞的分离纯化参考前人方法，进行稍许改良[6]。出生1 d 的SD 红皮鼠，75%乙醇消毒，置于冰盒上冷冻麻醉。沿着坐骨神经走向迅速分离，使神经充分暴露，尽快取出坐骨神经剪碎并放置于预冷的DMEM 培养基中，1 000 g 离心5 min，弃上清。随后加入1 mL 浓度为3 mg/mL 的胶原酶溶液37 ℃孵育30 min，1 000 g 离心5 min，弃上清。加入胰蛋白酶溶液37 ℃孵育10 min，弃上清，加入完全培养基重悬，过400 目筛网，并在中皿培养。过夜后，换含10 μmol/L 阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)培养48 h。随后换含2 μmol/L Forskolin 和50 ng/mL HRG 的培养基，继续培养细胞。当密度达到接触抑制时，吸出上清液，用1 mL 含Thy1.1 抗体的培养基重悬细胞，冰上孵育1 h，1 000 g 离心5 min，弃上清。再用1 mL 含补体的培养基37 ℃孵育1 h，离心，DMEM 高糖培养基重悬种于中皿等待后续实验。本实验严格遵守南通大学动物实验伦理委员会要求，保障实验动物福利。

1.3.2 施万细胞处理 5 μmol/L 的INT777 处理施万细胞，分为4 组：对照组(NC)、dbcAMP 处理组(终浓度为1 mmol/L)、INT777 处理组及dbcAMP+INT777 处理组。随后，为了进一步验证可能的作用机制，将施万细胞分为4 组：对照组(NC)、dbcAMP处理组(终浓度为1 mmol/L)、dbcAMP+INT777 处理组及dbcAMP+INT777+ComC(终浓度为10 nmol/L)处理组。药物处理24 h 后收样用于后续研究。

1.3.3 施万细胞总RNA 提取 实验过程严格按照说明书步骤进行。通过Trizol 试剂裂解施万细胞，经氯仿变性及异丙醇沉淀后，最终获得高质量的总RNA。测定浓度，定量至1 μg 后逆转录成cDNA 第1 链，4 ℃保存用于后续定量实时聚合酶链式反应试验(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)研究。

1.3.4 施万细胞总蛋白质提取 所有的步骤均在冰上进行。药物处理后的施万细胞中加入预冷的细胞裂解液RIPA 250 μL，用一次性细胞刮将细胞刮离，收集于1.5 mL 的离心管中。冰上敷育30 min，期间不断震荡，4 ℃，12 000 r/min 离心20 min 后，通过BCA 方法进行蛋白质定量。各组样品蛋白浓度调至相同水平，加入上样缓冲液，混匀后于100 ℃加热5 min，冷却至室温用于后续Western Blot 分析。

1.3.5 细胞免疫荧光 细胞种于24 孔板中预先放置的玻片上，处理完毕后弃上清，多聚甲醛固定。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗3 遍后室温封闭0.5 h，一抗过夜。第2 天PBS 洗净一抗，二抗室温孵育2 h，PBS 洗3 遍后染核。最后在载玻片上滴加荧光封片剂，将玻片正面盖在载玻片上，蔡司荧光显微镜拍照分析。

1.3.6 qPCR 按照Thermo Fisher 公司说明书要求进行实验，每个样品做3 个生物学重复，对结果中的Cq 值，按照2-ΔΔCt方法进行计算分析。引物序列为：18S rRNA 正向引物：5′-AGCTCCAATAGCGTATATTAAAG-3′；负向引物：5′-CGGTCCTATTCCATTATTCCTA-3′。Krox20 正向引物：5′-TGGGTTTAAGTATGGCTGTATA-3′；负向引物：5′-AGTTAGTGGTTCTGTGTTAGA-3′。MPZ 正向引物：5′-GGATAA GAAATAGCGGTTAGC-3′；负向引物：5′-TTGAGGCTGGTTCTACTG-3′。Oct6 正向引物：5′-TTCCTAATTTCTGACCCATCT-3′；负向引物：5′-GCAATAAAGATACAAAGAGAATGG-3′。

1.3.7 Western Blot 预先制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，加样后进行电泳和转膜。室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜。隔天用含有吐温的TBST 洗净一抗，室温孵育二抗1 h，TBST 洗净，最后配置显影液显影。

1.3.8 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，以表示，两组间比较采用t 检验，组间比较采用one-way ANOVA 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGR5 在施万细胞的定位 通过细胞免疫荧光技术观察TGR5 在施万细胞中的表达情况，结果显示TGR5 表达于施万细胞的膜与细胞质中(图1)。因此，施万细胞体外添加激动剂INT777 可有效激活TGR5。

2.2 INT777 抑制髓鞘相关因子的表达 qPCR 技术检测INT777 与dbcAMP 诱导分化施万细胞成髓鞘之间的关系。结果显示，5 μmol/L 的INT777 处理可显著抑制髓鞘相关基因如Krox20、Oct6 及MPZ 的表达(图2)。

图1 TRG5 在原代施万细胞中的表达定位

图2 INT777 抑制dbcAMP 诱导施万细胞成髓鞘模型中髓鞘相关基因的表达

2.3 INT777 激活施万细胞p-AMPK 信号通路 通过Western 印迹技术探究INT777 抑制髓鞘基因表达的可能机制，其中dbcAMP 可有效诱导体外施万细胞髓鞘的分化形成，因而通常用作阳性对照组。实验结果显示INT777 促进了p-AMPK 的表达，抑制p-ERK 与p-S6K 的活性(图3)，因此，推测INT777可能是通过激活AMPK 进而抑制S6K 活性来抑制施万细胞的成髓鞘过程。

图3 INT777 影响dbcAMP 诱导施万细胞成髓鞘模型中AMPK/S6K 信号通路

2.4 ComC 促进施万细胞髓鞘的形成 ComC 是AMPK 特异性的抑制剂，之前的实验结果显示INT777通过激活施万细胞AMPK 活性抑制了髓鞘相关基因的表达，为进一步证实这个猜想，随后在细胞内加入10 nmol/L ComC 来抑制AMPK 活性，qPCR 及Western Blot 结果显示相对于INT777 处理组而言，ComC 与INT777 双处理后逆转了INT777 对髓鞘基因表达的抑制效果(图4)。

3 讨论

PNS 中的外周神经纤维是传输神经冲动的主要载体，而外周神经纤维主要由轴突、髓鞘和结缔组织构成的神经内膜组成，其中影响神经冲动传导的关键是髓鞘[7]。髓鞘主要是由施万细胞以1∶1 模式包裹直径＞1 μm 的轴突而形成的[8]。施万细胞不仅在维持外周神经稳态和髓鞘发育过程中发挥重要作用，且能修复损伤的髓鞘[9]。

图4 ComC 挽救INT777 对施万细胞髓鞘相关基因表达的抑制作用

外周神经髓鞘形成过程分为预髓鞘阶段和成熟髓鞘阶段，是一个严谨的、由多种转录因子参与调控的复杂生理过程。研究[10]表明，转录因子Sox10 与Oct6 主要存在于预髓鞘阶段，Sox10 是施万细胞形成髓鞘并维持其稳定所必需的，且能激活Oct6，从而启动施万细胞进入预髓鞘化阶段。Sox10 与Oct6协同作用可诱导转录因子Krox20 的表达，从而促使预髓鞘阶段向髓鞘化阶段转变。Krox20 因子一方面可激活大量髓鞘化基因如MPZ 及髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达，另一方面可抑制去髓鞘化基因(Sox2、c-Jun)的表达，通过这两方面的作用，促进稳定成熟的髓鞘套的形成[11]。虽然对外周神经髓鞘形成过程的研究很多，但具体的作用机制并不十分清楚。

TGR5 属于GPCR 家庭成员，可以调节能量平衡和糖代谢过程，促进胰岛素的分泌和生物合成[12]，参与多种肿瘤的发生发展过程[13]，可激活炎症因子而产生抗炎、利胆作用[14]，也可减轻肝脏炎症，抑制动脉粥样硬化斑块形成[15]。TGR5 作为膜受体，可与相应配体结合内化到细胞质中，在核因子-κB、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)等信号通路中发挥重要作用[16-17]。该受体经典的下游靶标是cAMP(由乙酰辅酶A 催化ATP 后形成)，可直接提高体内PKA 活性，抑制AMPK 活性[18]。但是，本研究结果显示在施万细胞中5 μmol/L INT777 的处理激活了AMPK，推测这一现象可能与INT777 浓度有关。INT777、Deoxycholic acid、TGR5 Receptor Agonist 等都是TGR5 的激活剂，其中INT777 因其特异性佳，效果好，毒性小而常被研究者使用。研究[19]指出，溶血磷脂酸LPA 通过刺激施万细胞等胶质细胞来调节氯喹和TGR5 激动剂INT777 引起的神经元反应，如瘙痒、疼痛等症状。有研究[20]报道指出脂肪细胞及肝脏细胞经INT777 处理显著地提高了胞内cAMP 的表达，提高了细胞能量代谢效率，而INT777在dbcAMP 诱导的原代施万细胞成髓鞘模型中是否也发挥着同样的作用及具体的作用机制有待进一步研究。

众所周知，AMPK 的活化可以延缓合成代谢反应，降低能量消耗，已有报道[21]指出AMPK 可以负向调控外周神经髓鞘的发育。施万细胞中LKB1-AMPK和mTOR 信号网络调节轴突完整性和髓鞘的形成[22]。本研究中，INT777 的处理抑制了髓鞘相关因子Krox20、Oct6 及MPZ 的表达，且促进了p-AMPK的表达，这与前人[23]报道一致。mTOR 信号通路是调控外周神经髓鞘发育的经典的信号途径，而p-S6K是非常关键的调控因子[24]。髓鞘形成是一种代谢性生理过程，mTOR 信号通路作为一种协调细胞代谢的信号中枢，被认为是髓鞘形成的关键信号[25]。本研究显示INT777 的处理提高了p-AMPK 的表达，抑制了p-S6K 的活性，表明该药物对外周神经髓鞘的影响可能是通过激活AMPK、抑制S6K 活性来发挥作用的。为进一步验证这一猜想，在INT777 处理的施万细胞中又同时添加了AMPK 的抑制剂ComC，通过Western Blot 等证实ComC 的添加逆转了INT777 对髓鞘发育过程的抑制现象。表明INT777可能通过AMPK 信号通路发挥其对髓鞘化过程的影响。

总之，INT777 可抑制dbcAMP 诱导的施万细胞髓鞘化过程，并且是通过激活AMPK 活性，抑制S6K活性来实现的。