钟春琳，曹斯琼，孙冬梅，程学仁，潘礼业，叶瑞莲，周湘媛，李国卫

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山528244）

车前草为车前科植物车前Plantago asiaticaL.或平车前Plantago depressaWilld.的干燥全草，夏季采挖，除去泥沙，晒干，具有清热利尿通淋、祛痰、凉血、解毒的功效[1]。车前的性状是根丛生，须状；叶基生，具长柄，叶片皱缩，展平后呈卵状楠圆形或宽卵形，具明显弧形脉5～7 条；先端钝或短尖，基部宽楔形，全缘或有不规则波状浅齿。平车前的性状是主根直而长。叶片较狭，长椭圆形或椭圆状披针形。车前草主要有黄酮类、苯乙酰咖啡酰糖酯类、环烯醚萜类、三萜类化学成分，并具有抗感染、抗菌、抗溃疡、抗氧化等药理作用[2]。临床应用于流行性腮腺炎、慢性移动性肝炎、褥疮、压疮、产后尿潴留、隐匿性肾炎等病症的治疗[3-10]。

目前，针对车前草基原鉴别方法主要有性状鉴别、显微鉴别和应用ITS2 序列鉴别[11-13]。2020 年版《中国药典》一部主要以大车前苷的含量控制车前草药材的质量。由于车前与平车前基原不同，二者的化学成分组成及含量存在较大差异，仅靠单一的大车前苷含量难以真正评价其质量，且不同基原车前草植物形态和药材特征比较相似，药材采收加工后叶片皱缩破裂，仅靠药典含量测定方法无法准确鉴别。本研究采用UPLC 法建立车前草药材的特征图谱和大车前苷、木犀草苷、车前草苷D和毛蕊花糖苷等4种指标成分定量测定分析方法，能快速、准确地鉴别车前与平车前，可综合控制和评价二种基原车前草药材的质量。

1 仪器与材料

Waters H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）色谱柱；Mettler XP-26 百万分之一天平、ME204E 万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q 超纯水净化系统（美国Millipore 公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；水为Mili-Q 超纯水；其余试剂为分析纯。

大车前苷（批号：111914-201604，质量分数：90.2%）、木犀草苷（批号：111720-201609，质量分数：93.5%）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201914，质量分数：95.2%）对照品均由中国食品药品检定研究院提供；车前草苷D（批号：147331-98-4，质量分数：98.0%）对照品由上海诗丹德标准技术服务有限公司提供；实验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，S1～S14 号样品为车前PlantagoasiaticaL.，S15～S25 号 样 品 为 平 车 前Plantago depressaWilld.。药材具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱，流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为1 μL；检测波长为330 nm；以乙腈（A）-0.05%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，12%→13%A；5～15 min，13%→17%A；15～20 min，17%A；20～25 min，17%→88%A；25～26 min，88%→12%A；26～35 min，12%A）。

2.2 对照品溶液的制备

取大车前苷、木犀草苷、车前草苷D、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加60%（体积分数，下同）甲醇制成质量浓度分别为402.653 0、51.359 9、32.104 8、512.652 0 μg/mL 的混合对照品储备溶液。分别量取对照品储备液1、2、4、6、8 mL，置于10 mL量瓶中，用60%甲醇定容，滤过，得到系列浓度的混合对照品溶液。

表1 药材详情信息表Table 1 Information of samples

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过二号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1”项色谱条件连续进样6 次，以大车前苷为参照峰，计算7 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均＜2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.1”项色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，以大车前苷为参照峰，计算7 个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 值均＜2%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取样品粉末约1.0 g（S1），平行6份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，以大车前苷为参照峰，计算7个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD 值均＜2%，表明方法重复性良好。

2.4.4 特征图谱分析及评价

2.4.4.1 共有峰的确认 取25 批车前草样品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0 版本)”对25 批药材样品UPLC 特征图谱进行结果分析，分别对14 批车前和11 批平车前进行共有峰标识，分别以S1 和S15 号图谱作为参照图谱，以“平均数”法作为对照图谱生成方式，全峰匹配分别生成14批车前和11 批平车前的特征图谱，共标定了12 个共有峰，同时分别生成对照图谱R1 和R2，结果见图1～图2。通过与对照品比对，指认出其中4个主要成分，分别为峰6（大车前苷）、峰7（木犀草苷）、峰8（毛蕊花糖苷）和峰9（车前草苷D），结果见图3。选择2020 年版《中国药典》收载的车前草含量指标成分峰6（大车前苷）为参照峰，各色谱峰相对峰面积结果见表2。

2.4.4.2 相似度评价结果 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.0版本）”分别对S1～S25共25批车前草药材样品UPLC 特征图谱进行数据处理，采用平均数，时间窗口为1，自动匹配，计算相似度系数，结果见表3。可见，14批车前药材的相似度均在0.955～1.000之间，11批平车前药材的相似度均在0.992～1.000 之间，同一基原样品相似度高，相似度结果说明同种基原的车前草药材化学成分具有较好的一致性。分别把车前和平车前生成的对照图谱导入软件，两者的相似度值为0.441，说明两个基原药材化学成分差异性较大。

2.4.5 聚类分类 运用SPSS 22.0 软件对25 批药材样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，样品聚为两类（见图4）。S1～S14 为车前聚为Ⅰ类，S15～S25 为平车前聚为Ⅱ类，表明不同基原的药材样品具有显著差异性。

图1 14批车前药材UPLC特征图谱共有峰Figure 1 Common peaks of UPLC characteristic maps of 14 batches of Plantago asiatica L.

图2 11批平车前药材UPLC特征图谱共有峰Figure 2 Common peaks of UPLC characteristic maps of 11 batches of Plantago depressa Willd.

图3 对照品、供试品的UPLC图Figure 3 UPLC charts of reference substance and sample

2.4.6 主成分分析 以25 批药材样品特征图谱的12 个共有峰峰面积作为变量导入SPSS 22.0 软件进行主成分分析，提取2个特征值大于1的主成分。前2 个成分累计方差贡献值为87.105%，结果见表4。从表5可见，在第1主成分有较高载荷的包括峰1～6、峰8～11；在第2 主成分有较高载荷的包括峰7（载荷值＞0.80）。以降维得到的2 个主成分得分作为X、Y轴，得到25 个样品的散点分布图（见图5），结果显示，两种基原药材样品能实现较好区分，同基原样品能聚在同一区域，25 批车前草样品分为2 类，即S1～S14号样品为Ⅰ类，S15～25号样品为Ⅱ类。从表6 可见，车前基原的药材主成分1 得分均为正值，平车前基原的药材主成分1 得分均为负值，主成分1为区分两基原的主要因素。

2.5 质量分数测定

基于上述研究结果，为了区分车前与平车前药材之间的差异。对已进行归属的4个化学成分进行含量测定，进一步评价车前草药材的质量。

表2 25批车前草药材特征图谱的相对峰面积Table 2 The relative peak area of the characteristic map of 25 batches of Plantaginis Herba

表3 不同基原车前草药材样品相似度评价结果Table 3 Evaluation results of the similarity of different bases of Plantaginis Herba

图4 25批车前草药材样品聚类分析结果Figure 4 Cluster analysis results of 25 batches of Plantaginis Herba

2.5.1 检测限和定量限考察 取混合对照品溶液，以60%甲醇等比例稀释后，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，以信噪比3:1、10:1分别确定检测限和定量限。结果得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D 和毛蕊花糖苷的检测限分别是0.23、0.03、0.01、0.29 ng，定量限分别是0.79、0.10、0.04、0.99 ng。

2.5.2 标准曲线 取“2.2”项下的对照品储备液，加60%甲醇稀释制得5 个不同质量浓度的对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（y），质量浓度（μg/mL）为横坐标（x）进行线性回归计算，得到各个对照品的线性关系良好，结果见表7。

表4 特征峰、各主成分的贡献率Table 4 Contribution rate of characteristic peaks and principal components

表5 各因子初始因子载荷矩阵Table 5 Initial factor load matrix of each factor

图5 25批药材样品主成分得分分布图Table 5 Diagram of principal component score of 25 batches of samples

2.5.3 重复性试验 取样品粉末约1.0 g（S1），平行6份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项条件测定，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D 和毛蕊花糖苷质量分数的RSD 值均＜2%，表明方法重复性良好。

表6 25批车前草药材主成分得分Table 6 Principal component score of 25 batches of Plantaginis Herba

2.5.4 回收率试验 精密称取已知成分含量的车前草供试品粉末（S1）6 份，每份约1.0 g，分别精密加入一定量的对照品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，计算得到大车前苷、木犀草苷、车前草苷D和毛蕊花糖苷的平均加样回收率分别为94.29%、94.45%、96.38%、87.23%，RSD分别为1.30%、2.07%、1.68%、1.92%，表明方法准确度良好。

2.5.5 质量分数的测定 取25批样品，精密称定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，测定结果见结果见表8。可见，大车前苷和木犀草苷为车前和平车前共有成分，车前的大车前苷质量分数明显高于平车前，分别为0.18%、0.01%；两个基原样品木犀草苷质量分数差异较小，均值分别为0.15%、0.17%，且两组样本质量分数互有高低；车前草苷D可在车前基原样品检出，平均质量分数为0.03%；毛蕊花糖苷可在平车前基原样品检出，平均质量分数为1.48%。

3 讨论

本研究对比甲醇、30%甲醇、60%甲醇、60%乙醇和乙醇5 种提取溶剂对车前草药材的提取效果，发现60%甲醇提取效果最好，乙醇提取的效果最差，因此选用60%甲醇作为提取溶剂；同时对超声和加热回流2 种提取方式进行考察，结果加热回流提取方式峰面积/称样量的值更大，因此选用加热回流提取方式。

本研究建立了同时测定不同基原车前草药材UPLC 特征图谱及4个特征性成分含量的方法，并采用聚类分析和主成分分析对不同基原的25 批车前草样本进行了分析，结果显示车前和平车前有着显著性的差异，大车前苷和木犀草苷为车前和平车前共有成分，车前的大车前苷含量明显高于平车前，两个基原样品木犀草苷含量差异较小；而车前草苷D 成分只在车前中检出，毛蕊花糖苷成分只在平车前中检出；相似度评价结果则显示，14 批车前的相似度均大于0.955，11 批平车前的相似度均大于0.992，说明不同产地同一基原的车前草表现出良好的相似度，聚类分析可以将2 种基原区分开。本文结果为车前草药材的质量控制和基原鉴别提供了可靠的分析方法与参考依据。

表8 25批车前草大车前苷、木犀草苷、车前草苷D与毛蕊花糖苷质量分数测定结果Table 8 The determination results of Plantagoside,Cynaroside,Plantainoside D and Acteoside in 25 batches of samples w/%