李小娜　李开瑞　何迎春　徐朝军　宋岚

〔摘要〕 目的 研究血根碱（sanguinarine， SAN）对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 将肺腺癌A549细胞随机分为空白组、SAN不同浓度（1.25、2.5、5、10 μmol/L）组、阳性组。采用噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide， thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT]法和实时无标记动态细胞分析技术（real time cellular analysis， RTCA）检测细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡;采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测增殖相关蛋白（PCNA）、周期相關蛋白（Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4）、凋亡相关蛋白（Bax、XIAP、Survivin）表达水平。结果 MTT法和RTCA检测结果均显示，不同浓度SAN均能够抑制肺腺癌A549细胞增殖（P<0.01）。流式细胞术检测结果显示，不同浓度SAN（2.5、5 μmol/L）处理肺腺癌A549细胞24 h后，其G1期比例显著增加（P<0.01）。AnnexinV-FITC/PI双荧光染色法结果，经SAN（2.5、5 μmol/L）处理24 h后的肺腺癌A549细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。Western blot结果显示，经SAN干预后的肺腺癌A549细胞的增殖相关蛋白PCNA（P<0.01）、周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin D3、CDK4（P<0.01）、抗凋亡蛋白Survivin、XIAP（P<0.05或P<0.01）表达水平均显著降低，促凋亡蛋白Bax（P<0.01）表达水平明显提高。结论 SAN能抑制肺腺癌A549细胞增殖，将其细胞周期阻滞于G1期，并可诱导其细胞凋亡。

〔关键词〕 血根碱;肺腺癌A549细胞;增殖;凋亡;细胞周期

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.011

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of sanguinarine （SAN） on proliferation， apoptosis and cell cycle of lung adenocarcinoma A549 cells and to explore its mechanism. Methods Lung adenocarcinoma A549 cells were randomly divided into the blank group， different concentrations of SAN （1.25， 2.5， 5， 10 μmol/L） groups and the positive group. 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，thiazolyl blue tetrazolium bromide （MTT） and real-time cellular label free dynamic analysis （RTCA） were used to detect the cell proliferation. Flow cytometry was performed to evaluate the cell cycle distribution. Annexin V-FITC/PI double fluorescent staining was used to detect the cell apoptosis. Western blot was used to detect the expression levels of proliferation-related protein （PCNA）， cell cycle-related proteins （Cyclin D1， Cyclin D3， CDK4）， and apoptosis-related proteins （Bax， XIAP， Survivin） Results The results of MTT and RTCA showed that SAN at different concentrations could inhibit the proliferation of lung adenocarcinoma A549 cells （P<0.01）. Flow cytometry showed that the G1 phase proportion of lung adenocarcinoma A549 cells was significantly increased （P<0.01） after treated with different concentrations of SAN （2.5， 5 μmol/L） for 24 h. Annexin V-FITC/PI double fluorescent staining showed that the apoptosis rate was significantly increased （P<0.01） after treated with SAN （2.5， 5 μmol/L） for 24 h. Western blot showed that， the expression of proliferation-related protein PCNA （P<0.01）， cell cycle-related protein Cyclin D1， Cyclin D3 and CDK4 （P<0.01）， and anti apoptotic protein Survivin and XIAP （P<0.05 or P<0.01） were decreased， while the expression of pro-apoptotic protein Bax was significantly increased （P<0.01）. Conclusion SAN can inhibit the proliferation and arrest the cell cycle in G1 phase， and induce apoptosis of lung adenocarcinoma A549 cells.

2.5  Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡率

分组同“2.4”，药物处理24 h后，消化、离心、收集沉淀移至EP管，各组加入100 μL 1×binding buffer重悬细胞，再分别加入5 μL FITC和10 μL PI，避光染色15 min后再加入100 μL 1×binding buffer终止染色，轻轻混匀，防止因混匀力度较大而出现细胞碎片，于荧光双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

2.6  Western blot检测相关蛋白表达水平

将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞悬液均匀平铺于10 cm的培养皿中，分组同“2.4”。SAN处理24 h后，每皿加入100 μL裂解液，放置冰上裂解，用细胞刮将细胞及混合液刮至皿边缘，再用移液枪移至1.5 mL EP管中，放置4 ℃冰箱裂解30 min，进行离心（12 000 r/min，10 min，离心半径15 cm），收集细胞上清，用BCA蛋白试剂盒测蛋白浓度，配置样品并放置金属浴（100 ℃/10 min）进行蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳，按照顺序为滤纸+胶+PVDF膜+滤纸进行湿转。加入25%脱脂牛奶，放置摇床封闭1 h，用TBST洗净残余的封闭牛奶液，根据目的条带位点……