张冰冰，张国珍，樊莉娟，王 菲，秦小波，，徐 莺

（1.四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2.四川省自然资源科学研究院，成都610015）

暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）隶属于牛肝菌目（Boletales）小牛肝菌科（Boletaceae）网柄牛肝菌属（Phlebopus），主要分布于热带地区，中国主要分布在四川、云南、广西、海南等地［1］。牛肝菌目食用菌营养丰富，风味独特，深受消费者喜爱，市场消费前景好［2］。但是，目前实现人工栽培的牛肝菌目种类还只有暗褐网柄牛肝菌，其栽培模式是利用组织分离法［3］从子实体上获得母种菌丝，进而繁育出原种、栽培种，最终获得商业化子实体。因此，优质母种菌丝是获得优质子实体的基础。研究表明母种菌丝的长势会随着继代次数的增加而减弱，需要适合的母种培养基予以维持［4⁃5］。本研究在对收集的暗褐网柄牛肝菌进行分子鉴定的基础上，对分离出的菌丝生长所需的氮源、氮源浓度、无机盐和维生素B1 进行了优化探究，以期为暗褐网柄牛肝菌的人工栽培技术的发展提供实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

野生牛肝菌样品采集于中国西南地区，通过组织分离法获得纯化菌株。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

参照张春霞等［6］的描述对其进行形态学鉴定。

1.2.2 基于rDNA ITS序列分析的分子鉴定

采用DNA 提取试剂盒（天根生化北京有限公司）进行提取子实体DNA 为模板，利用rDNA ITS 通用引物ITS1（5'⁃TCCGTAGGTGAACCTGCGG⁃3'）与ITS4（5'⁃TCCTCCGCTTATTGATATGC⁃3'）（上海生工生物工程技术服务有限公司）进行PCR 扩增。PCR 扩增反应使用2×TSING Master Mix体系（擎科生物技术有限公司），在BIO⁃RAD T100TM Thermal Cycler PCR 仪上进行。PCR反应参数：94 ℃预变性3 min；……