张 靖，张 婷，孙 强，朱 婷，石晓卫

（新乡医学院三全学院，新乡453003）

基因治疗是转基因技术中比较热门的研究内容，需要建立一个安全、高效的载体转移系统［1⁃2］。最常用的转移载体是逆转录病毒载体［3⁃4］。原因是重组病毒具有天然侵袭细胞、整合宿主细胞的能力，且基因组结构简单，感染的效率以及特异性也优于其他载体。但病毒的整合是随机的［5］，外源基因表达可能会受到基因组干扰出现沉默问题［6⁃8］。有效提高逆转录病毒载体外源基因表达是一个急需解决的问题［9］。有文献显示MAR 序列参与转录调节［10⁃11］，在克服外源基因沉默［12⁃14］、提高转基因表达效率［15］方面可以起到显著作用。但是否能提高逆转录病毒载体表达效率还需进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP 等购自宝生物工程（大连）（TaKaRa）有限公司；CAT⁃ELISA 检测试剂盒购自德国Roche Diagnostics Gmbh 公司。

1.2 方法

1.2.1 MAR序列扩增

根据GenBank 报道的人β⁃珠蛋白核基质结合区［16⁃17］（No：L22754）使用Primers 软件设计如下引物：正向引物：5'⁃TTAGTAAGACATCACCTTGCATTT⁃3'；反向引物：5'⁃AGCCATAGTTTGAGTTACCCTTT⁃3'。改良降落PCR 程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，59 ℃～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，每个退火温度4个循环，55 ℃又进行了30个循环。

1.2.2 载体构建

实验中构建3 种载体。首先，构建中间载体pLXSN⁃CAT。将pLXSN 质粒、连接CAT 片段的vector用HpaⅠ/XhoⅠ酶切后连接、转化、鉴定。其次，构建5'端含有MAR 序列的载体pLXSN5⁃CAT，连接MAR 片段的T⁃vector、pLXSN⁃CAT 质粒用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切后连接、转化与鉴定。最后，构建3'端含有MAR 序列的载体pLXSN3⁃CAT，连接MAR 片段的T⁃vector、pLXSN⁃CAT 质粒用XhoⅠ/BamHⅠ酶切后连接、转化与鉴定。

1.2.3 细胞转染

细胞转染实验分为3 组进行，即pLXSN5⁃CAT 载体转染组、pLXSN3⁃CAT载体转染组和pLXSN⁃CAT载体转染组。在24 孔板中以每孔1×105个细胞接种包装细胞PA317，当孔中细胞到70%～80%融合时的阳离子聚合物法转染3种载体［18］。……