李雄飞，胡 伟，周明安，田少斌

湖北省天门市第一人民医院神经外科，湖北天门 431700

脑外伤是常见的神经外科急症，脑外伤患者主要临床特征有认知功能、语言功能障碍。有研究发现，神经炎性反应是脑损伤的并发症之一，神经炎症治愈难，容易复发，最终导致患者神经功能受损[1-2]。继发性癫痫是重度脑外伤常见的并发症。癫痫是由于脑部神经元异常导致的中枢神经系统功能失常，癫痫反复发作会导致脑功能损伤。相关文献显示，微小RNA参与神经系统疾病和脑缺血所致神经损伤[3]；也有研究显示，微小RNA在癫痫的发生中起重要作用[4]。微小RNA-146a(miR-146a)是一种调节Toll样受体(TLRs)信号通路和炎症因子受体信号通路的内源性调节因子，在炎症性疾病中发挥重要作用[5]。但是目前鲜有文献报道重度脑外伤患者中miR-146a与癫痫发病的关系。本文旨在研究重度脑外伤患者血清miR-146a水平与继发性癫痫之间相关性，为早期干预和治疗重度脑外伤继发性癫痫提供新依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2020年2月本院收治的重度脑外伤住院患者104例为研究对象，其中男60例，女44例；年龄23～76岁，平均(38.92±15.86)岁。按照是否继发癫痫分为重度脑外伤继发性癫痫组61例，单一重度脑外伤组43例。纳入标准：(1)重度脑外伤诊断标准参照《重型颅脑损伤救治指南》[6]；(2)癫痫的诊断依据2010年国际抗癫痫联盟(ILAE)制定的癫痫发作和癫痫综合征的分类方法[7]，结合临床表现、脑电图、头颅MRI、家族史等诊断为原发性癫痫；(3)重度脑外伤后出现2次以上癫痫发作；(4)外伤前无癫痫病史，无家族遗传史。排除标准：(1)有脑出血、脑梗死病史；(2)有脑血管畸形者；(3)患有自身免疫性疾病者；(4)有癫痫病史或家族遗传癫痫者；(5)其他原因引起继发性癫痫者；(6)临床资料不全者。重度脑外伤继发性癫痫患者脑外伤后24 h内出现癫痫11例，2周内发作35例，1个月内发作15例。选取同期本院体检健康者70例为对照组，其中男40例，女30例；年龄22～78岁，平均(39.14±16.12)岁。重度脑外伤患者与对照组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究征得所有受试者和其家属同意，并签署知情同意书；本研究通过本院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、人白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，批号bsk11014、bs-0782R)；白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(武汉默沙克生物公司，批号69-86579)；miRNA提取试剂盒(日本Takara公司，批号RA207004)；RNA SYBR Green PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(上海康朗生物科技有限公司，批号KL101-969)；逆转录试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司，批号Q6099)；Multiskan FC型全自动酶标仪(美国Thermo公司)；5427R型艾本德台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；SmartSpec Plus型核酸纯度分析仪(美国伯乐公司)；CFX96型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集和处理 脑外伤患者入院24 h内、对照组入院体检当天抽取研究对象静脉血4 mL，装入EP管中，室温静置35 min后，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集上清液，分装，保存于-80 ℃备用。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外周血miR-146a的表达 将样品和试剂在常温下复融，打开超净工作台灭菌30 min。在无菌超净工作台和冰盒上提取总RNA，用核酸纯度分析仪测量A260 nm/A280 nm是否在1.8～2.0，并将提取的RNA分装保存于-80 ℃备用。依据cDNA逆转录步骤，按照逆转录参数合成cDNA。采用qRT-PCR测定miR-146a水平，在避光环境下严格按照荧光定量PCR试剂盒操作步骤，利用qRT-PCR仪按照设定程序进行操作。程序设定参数为94 ℃预热1 min，94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 20 s，共35个循环。总反应体系(20.0 μL)：SYBR Green mix 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 3.0 μL。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，每例样本重复操作3次，记录Ct值，以U6为内参，采用2-ΔΔCt算法计算miR-146a相对表达量。引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3TNF-α、IL-6、IL-1β水平检测 采用TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒检测所有受试者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 结 果

2.13组受试者血清miR-146a水平比较 与对照组相比，重度脑外伤继发性癫痫组、单一重度脑外伤组患者血清miR-146a水平较高(P<0.05)，与单一重度脑外伤组相比，重度脑外伤继发性癫痫组患者血清miR-146a水平较高(P<0.05)。见表2。

表2 3组受试者血清miR-146a水平比较

2.23组受试者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 与对照组相比，重度脑外伤继发性癫痫组、单一重度脑外伤组患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较高(P<0.05)，与单一重度脑外伤组相比，重度脑外伤继发性癫痫组患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较高(P<0.05)。见表3。

表3 3组受试者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

2.3重度脑外伤继发性癫痫患者血清miR-146a水平与血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平相关性分析 重度脑外伤继发性癫痫患者血清miR-146a与TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈正相关(r=0.580、0.505、0.474，P<0.05)。

2.4影响重度脑外伤继发性癫痫多因素分析 以是否发生继发性癫痫为因变量，以血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示血清miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是重度脑外伤继发性癫痫的危险因素(P<0.05)。见表4、表5。

表4 变量赋值

表5 影响重度脑外伤继发性癫痫的多因素分析

3 讨 论

继发性癫痫是重度脑外伤后常见的严重并发症，进一步加重了脑组织病理和神经损伤[8]。继发性癫痫使重度脑外伤致残率、病死率不断上升。有研究显示，癫痫发病过程与炎症因子和神经系统炎症相关[9]。神经系统炎症在癫痫发作过程中发挥着重要作用，这与脑损伤有重要关系[10]。TNF-α、IL-6、IL-1β是与神经系统炎症相关的细胞因子，在癫痫发作中发挥重要作用[11]。恽鸿博等[9]研究发现脑梗死继发癫痫组和单一脑梗死组患者血清TNF-α、IL-1β水平明显高于健康体检组，脑梗死继发癫痫组患者血清TNF-α、IL-1β水平明显高于单一脑梗死组患者。本研究发现，与对照组相比，重度脑外伤继发性癫痫组、单一重度脑外伤组患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著较高，与单一重度脑外伤组相比，重度脑外伤继发性癫痫组患者血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显较高，提示炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β在继发性癫痫发病过程中可能发挥重要作用。

近年来研究发现，微小RNA在癫痫疾病发病过程中具有重要作用[4]。miR-146a是第一个被发现的具有免疫调节作用的微小RNA，在炎性反应、细胞分化、免疫反应等生物学过程中发挥重要作用[12]。LV等[13]发现miR-146a能影响巨核细胞增殖、分化，可能通过TLR4信号通路调控血小板免疫炎性反应。DENG等[14]也发现miR-146a在人星形胶质细胞中水平呈上升趋势，且miR-146a可通过抑制TLR4信号通路调节炎性细胞因子释放。ORGANISTA-JUREZ等[15]发现颞叶癫痫患者大脑新皮层miR-146a水平显著上调，且与癫痫发作频率相关。ANSARI等[16]报告阿尔茨海默病患者的反应性星形胶质细胞中miR-146a水平显著增加，miR-146a可能参与了大脑发育和神经变性。本研究发现，重度脑外伤继发性癫痫组、单一重度脑外伤组患者血清miR-146a水平皆显著高于对照组(P<0.05)，重度脑外伤继发性癫痫组血清miR-146a水平显著高于单一重度脑外伤组(P<0.05)，提示miR-146a可能参与重度脑外伤继发性癫痫的发生。ZHANG等[17]研究发现癫痫大鼠脑组织中miRNA-146a水平显著高于对照组，且与促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平变化相同，本研究进一步发现，miR-146a与IL-1β、IL-6和TNF-α呈正相关(P<0.05)，提示重度脑外伤患者miR-146a可能通过影响IL-1β、IL-6和TNF-α进一步影响继发性癫痫发作。进一步分析发现miR-146a、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高是影响继发性癫痫的危险因素，提示检测血清miR-146a水平可为临床诊断继发性癫痫的发生提供参考依据。

综上所述，重度脑外伤继发性癫痫患者血清miR-146a水平上调，miR-146a是影响继发性癫痫的危险因素，监测重度脑外伤患者血清miR-146a有助于诊断继发性癫痫的发生。本研究由于样本数量有限，研究结果具有一定的局限性。本课题组将进一步增加样本量探讨重度脑外伤患者血清miR-146a与继发性癫痫的关系。