王 成，孔亚林，刘承利，蒲 猛，赵 刚，张洪义

Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）是Hippo通路下游的一种转录激活子[1]，它所在的Hippo通路主要行使调控细胞增殖功能。YAP蛋白与人和小鼠的肝癌进展密切相关[2-3]。YAP基因在其他实体癌中[4-6]也被视为一种癌基因。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肝细胞增殖的负性调节因子，在肝再生晚期表达增强[7]。肝癌患者外周血中TGF-β1 mRNA明显升高[8]。TGF-β1可通过激活Hippo通路来抑制YAP功能，从而抑制肝癌细胞增殖[9]，2种因子在调控肝癌细胞增殖方面关系密切。目前针对YAP的靶向抑制是控制肝癌增殖的热点，但靶向治疗是否会带来相关因子的变化和新的问题需要更多的关注。本研究拟应用RNA干扰技术下调MHCC97H细胞中YAP mRNA水平，测试干扰后该细胞中TGF-β1 mRNA的变化，将有利于针对YAP基因的靶向治疗的研究。另外，前期研究发现，MHCC97H细胞的YAP mRNA高于与其同源的另一肝癌细胞MHCC97L[10]。本研究拟测试YAP mRNA水平较低的MHCC97L细胞中TGF-β1 mRNA水平，并与MHCC97H细胞内TGF-β1 mRNA水平相比较，进一步在自然存在的肝癌细胞中寻找二者相关性的有力证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞系MHCC97（包括97H和97L）购自上海细胞库，是裸鼠人肝癌转移模型在体外建立的（97H肺转移率为100%，97L肺转移率较低，为40%）。

1.1.2 RNA干扰序列 用于行YA P基因干扰的序列选自短发夹R N A克隆库。有效抑制靶点序列：YAP1 NM_001130145 Human,5'-CATTGCTGCTGTTAATGTA-3'。

1.1.3 PCR引物 所有引物为人源，由上海生工公司设计合成，经Primer BLAST（NCBI）验证特异性好。Y A P引物：正向链序列：5'-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3'，反向链序列5'-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3'，引物长度257 b p；TGF-β1引物：正向链序列5'-TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3'，反向链5'-CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'，引物长度131 bp；内参GAPDH引物：正向链序列5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向链序列5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'，引物长258 bp。

1.1.4 主要试剂、仪器 培养液：高糖DMEM（Hyclone）＋10%胎牛血清（Gibco），培养液加青、链霉素各100单位/ml。……