青翘和老翘的HPLC指纹图谱比较及聚类分析、主成分分析

2021-04-27王越欣苗雨露王梅李宁武英茹张文智冯敏倪艳

中国药房 2021年6期

王越欣苗雨露王梅李宁武英茹张文智冯敏倪艳

摘要目的：建立青翹和老翘药材的指纹图谱并比较，同时进行聚类分析和主成分分析。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil C18，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱），检测波长为235 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。以连翘苷为参照，绘制8批青翘（Q1～Q8）和6批老翘（L1～L6）药材的HPLC指纹图谱;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价，确定共有峰;采用SPSS 23.0软件进行聚类分析和主成分分析。结果：青翘和老翘药材共有19个共有峰，指认了其中6个，分别为连翘酯苷A、芦丁、松脂素-β-D-葡萄糖苷、连翘苷、槲皮素、连翘脂素;青翘与老翘药材的相似度为0.351～0.767。聚类分析结果显示，青翘和老翘药材样品可聚为4类，其中L1～L6聚为一类、Q1聚为一类、Q2～Q6聚为一类、Q7～Q8聚为一类。主成分分析结果显示，前3个主成分的累积方差贡献率为83.14%，L1～L6分布较近，Q2～Q6分布较近，Q7～Q8分布较近，Q1分布较为独立，与聚类分析结果一致。结论：青翘和老翘的指纹图谱共有峰经相似度评价、聚类分析及主成分分析均有明显差异，所建HPLC指纹图谱可用于综合评价和比较青翘和老翘药材的质量。

关键词青翘;老翘;高效液相色谱法;指纹图谱;相似度分析;聚类分析;主成分分析

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）06-0663-06

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish and compare HPLC fingerprints of green Forsythia suspensa and grown F. suspensa， and to conduct cluster analysis and principle component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Hypersil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid （gradient elution）. The detection wavelength was 235 nm and column temperature was 25 ℃ with the flow rate of 1.0 mL/min. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprints of 8 batches of green F. suspensa （Q1-Q8） and 6 batches of grown F. suspensa （L1-L6） were drawn， with phillyrin as reference; the similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， and common peak was confirmed. Cluster analysis and principal component analysis were carried out with SPSS 23.0 software. RESULTS： There were 19 common peaks for green F. suspensa and grown F. suspensa， among which 6 peaks were identified， i.e. forsythoside A， rutin， pinoresinol-β-D-glucoside， phillyrin， quercetin and phillygenin; the similarities of HPLC fingerprints from green F. suspensa and grown F. suspensa were 0.351-0.767; results of cluster analysis showed that green F. suspensa and grown F. suspensa were classified into 4 categories， among which L1-L6 were clustered into one category， Q1 was clustered into one category， Q2-Q6 were clustered into one category; Q7-Q8 were clustered into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of the first three principal components was 83.14%， L1-L6 distribution was close， Q2-Q6 distribution was close， Q7-Q8 distribution was close， and Q1 distribution was independent， which was consistent with the results of cluster analysis. CONCLUSIONS： There were significant differences in the common peaks of fingerprint of green F. suspensa and grown F. suspensa of similarity eraluation， cluster analysis and principle component analysis， the established HPLC fingerprint can be used for comprehensive evaluation and quality comparison of green F. suspensa and grown F. suspensa.

KEYWORDS Green Forsythia suspensa; Grown Forsythia suspensa; HPLC; Fingerprint; Similarity analysis; Cluster ana- lysis; Principal component analysis

连翘为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl.的干燥果实，主产于我国山西、山东、河南、河北、陕西等地，具有清热解毒、消肿散结的功效[1]。现代药理研究发现，连翘具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，且已被广泛用于肝炎、脑膜炎、呼吸道感染、急性肾炎等症的临床治疗[2]。连翘含有多种化学成分，如苯乙醇苷类、木脂素类、三萜类、黄酮类、酚酸类等，因此仅以连翘苷和连翘酯苷A作为该药材质量评价的指标具有一定的局限性[3]。

根据采收期的不同，连翘分为青翘和老翘，其中前者采收于果实初熟尚带绿色时，后者则采收于果实熟透时[4]。有研究指出，青翘和老翘在很多方面存在差异，首先在化学成分方面，青翘中有多种成分的含量均明显高于老翘，如黄酮类、木脂素类以及挥发油类成分[5-7]，而老翘中微量元素的含量高于青翘[8];其次在药效方面，青翘与老翘均有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等作用，其中青翘的抗氧化、抗炎作用优于老翘，而老翘的抗菌作用与青翘相当，甚至优于青翘[9-10]。2015年版《中国药典》（一部）仅对青翘和老翘的杂质、浸出物限度作了不同要求[1];而2020年版《中国药典》（一部）虽然增加了连翘中挥发油的含量测定，但仅对青翘作了规定，成分方面也仅对连翘酯苷A的含量进行了区分[11]。因此，进一步区分青翘和老翘的差异对于制定完善的连翘质量标准与临床用药规范具有重要的指导意义[12]。

近年来，因指纹图谱技术在反映中药材的物质特征中具有稳定性好和特征性强的优势，而被广泛用于中药材的质量控制领域[13]。虽然，已有关于连翘高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的报道[14-15]，但這些研究主要是将不同产地、市售不同批次青翘药材或青翘不同极性部位的HPLC指纹图谱进行比较[16-18]，或采用不同技术（如近红外光谱技术）对连翘进行鉴别[19-20];同时，目前尚未有将青翘和老翘药材指纹图谱进行对比的研究。基于此，本研究建立了青翘和老翘的HPLC指纹图谱，并采用聚类分析和主成分分析对两者质量进行评价，旨在为青翘与老翘的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有UltiMate 3000型HPLC仪（包括溶剂泵、自动进样器、柱箱、可变波长检测器、ChromeleonTM 6.80色谱工作站，戴安中国有限公司）、FW-100型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）、LC-300B型数控超声波清洗机（山东济宁鲁超超声设备有限公司）、SE402F型电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]等。

1.2 主要药品与试剂

连翘苷对照品（批号110821-201112，纯度96.8%）、连翘酯苷A对照品（批号111810-201606，纯度93.4%）、芦丁对照品（批号100080-201408，纯度90.2%）、槲皮素对照品（批号100081-200907，纯度97.4%）均购自中国食品药品检定研究院，连翘脂素对照品（批号141107，纯度98.0%）、松脂素-β-D-葡萄糖苷对照品（批号140325，纯度98.0%）均购自成都普菲德生物技术有限公司;乙腈、甲酸为色谱纯，甲醇等其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

8批青翘（编号Q1～Q8）和6批老翘（编号L1～L6）药材经山西省中医药研究院倪艳教授鉴定均为木犀科植物连翘F. suspensa（Thunb.）Vahl.的干燥果实。其中，青翘质硬、多不开裂，表面呈绿褐色，突起的灰白色小斑点较少;种子多数呈黄绿色且细长，一侧有翅。老翘质脆自顶端开裂或裂成两瓣，表面呈黄棕色或红棕色，内表面多为浅黄棕色，平滑，具一纵隔;种子呈棕色，多已脱落。8批青翘和6批老翘药材样品信息来源见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Hypersil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min，10%A→20%A;20～50 min，20%A→40%A;50～55 min，40%A→65%A;55～65 min，65%A→90%A），检测波长为235 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取连翘苷、连翘酯苷A、芦丁、槲皮素、连翘脂素、松脂素-β-D-葡萄糖苷对照品适量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含连翘苷0.2 mg和连翘酯苷A、芦丁、槲皮素、连翘脂素、松脂素-β-D-葡萄糖苷各0.1 mg的混合对照品溶液，摇匀，于4 ℃贮藏，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末（过五号筛）约0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察取“2.3”项下供试品溶液（编号Q1）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以连翘苷为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.2 稳定性考察取“2.3”项下供试品溶液（编号Q1）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以连翘苷为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性考察取药材样品（编号Q1）适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以连翘苷为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.5 青翘和老翘HPLC指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱的建立取8批青翘（编号Q1～Q8）和6批老翘（编号L1～L6）样品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以连翘苷为参照，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行分析，采用中位系数法对各色谱峰进行多点校正并自动匹配生成对照谱图（R）和HPLC叠加指纹图谱，详见图1、图2。

2.5.2 共有峰的指认对青翘和老翘药材样品指纹图谱进行数据匹配，共有19个共有峰。通过与混合对照品色谱图（见图3，取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样所得）比对，指认出了其中6个共有峰，分别为连翘酯苷A（11号峰）、芦丁（12号峰）、松脂素-β-D-葡萄糖苷（13号峰）、连翘苷（17号峰）、槲皮素（18号峰）和连翘脂素（19号峰）。因17号峰（连翘苷）的含量相对较高且分离度较好，故以其为参照峰。

2.5.3 相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》进行相似度评价。结果，8批青翘药材样品的相似度分别为0.867、0.983、0.968、0.982、0.982、0.980、0.867、0.937，6批老翘药材样品的相似度分别为0.909、0.875、0.946、0.910、0.949、0.948;青翹与老翘药材样品的相似度为0.351～0.767，且青翘与老翘对照指纹图谱的相似度为0.609，表明两者成分存在明显差异。8批青翘与6批老翘药材样品的相似度结果见表2。

2.6 聚类分析

将8批青翘和6批老翘药材样品的19个共有峰峰面积导入SPSS 23.0软件，采用组间连接法以欧氏平方距离为测度进行聚类分析。结果，8批青翘和6批老翘可聚为4类，其中L1～L6聚为一类、Q1聚为一类、Q2～Q6聚为一类、Q7～Q8聚为一类，详见图4。

2.7 主成分分析

将8批青翘和6批老翘药材样品的19个共有峰峰面积导入SPSS 23.0软件，对经标准化处理后的共有峰峰面积进行主成分分析。结果，以特征值>1为提取标准[21]，得到前3个成分（即主成分）的累积方差贡献率，为83.14%，表明这3个主成分可以代表青翘和老翘药材样品指纹图谱中19个共有峰的大部分信息，详见表3。

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向[17]。采用SPSS 23.0软件对8批青翘和6批老翘药材样品中的19个共有峰主成分进行载荷矩阵分析。结果，共有峰3、7～8、13～17对主成分1贡献较大，且与其成正相关;共有峰5～6对主成分2贡献较大，且与其成正相关;共有峰19对主成分3贡献最大，且与其成负相关，详见表4。

采用SPSS 23.0软件对上述主成分载荷值进行分析，以各自主成分载荷向量除以各自主成分特征值的算术平方根得到主成分系数，各主成分的线性模型如下：Y1=-0.225X1-0.094X2+0.266X3+0.169X4-0.057X5-0.025X6+0.265X7+0.303X8+0.226X9-0.191X10+0.216X11+0.217X12+0.279X13+0.313X14+0.280X15+0.282X16+0.309X17-0.252X18-0.023X19;Y2=0.300X1+0.325X2-0.091X3+0.248X4+0.428X5+0.428X6+0.185X7+0.145X8-0.061X9+0.252X10-0.341X11-0.063X12-0.149X13+0.081X14-0.156X15+0.150X16+0.003X17+0.222X18+0.022X19;Y3=0.205X1-0.066X2+0.130X3+0.144X4-0.075X5+0.107X6+0.188X7-0.012X8+0.358X9+0.266X10+0.107X11+0.213X12+0.203X13+0.014X14-0.184X15-0.190X16-0.065X17-0.281X18-0.643X19。其中，Y1、Y2、Y3分别表示第1、2、3个主成分得分，X1～X19分别表示19个共有峰峰面积的标准化数据。将X1～X19数据代入上述线性模型后，得到各批样品的主成分得分，结果见表5。

将表5中的数据录入SPSS 23.0软件，绘制主成分得分图。结果，L1～L6分布较近，表明6批老翘药材样品的质量较为接近;8批青翘中，Q2～Q6分布较近，Q7～Q8分布较近，表明对应批次青翘药材样品质量较为接近;而Q1分布较为独立，表明其与其他药材质量相差甚远。上述结果与聚类分析结果一致，详见图5。

3 讨论

由于采收连翘药材的过程中“抢青”现象严重，加之老翘资源减少，使得青翘和老翘常混用不分[22]。尽管2020年版《中国药典》（一部）对青翘和老翘的质量控制作出了不同规定，但两者的功能与主治并未区分。经成分学分析发现，老翘有效成分的含量常低于青翘[23]，这对于青翘和老翘的质量控制和临床用药都会造成不小的困扰。

本研究试验前期对不同流动相体系（乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）进行考察。结果，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，所得色谱峰的峰形较好，且峰数量较多，故选择乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相。

连翘质量评价的有效办法之一就是建立系统、全面、特征性强的指纹图谱[24]。本研究所建指纹图谱中，青翘和老翘药材共有19个共有峰，但相似度较低，为0.351～0.767，其原因可能为各色谱峰保留时间基本一致，但峰面积相差较大，提示两者成分可能存在差异。后期可扩大样本量，采用分离、制备液相色谱结合液质联用、核磁共振技术等对其化学结构进行分析。

聚类分析结果显示，青翘和老翘药材样品可聚为4类，其中L1～L6聚为一类、Q1聚为一类、Q2～Q6聚为一类、Q7～Q8聚为一类，可能与采收时间过长致样品质量发生变化，或采集时间、地理位置差异有关[25]。此外，Q1与其他批次样品差异较大，由青翘指纹图谱（图2）推测，可能与Q1图谱中多数色谱峰峰面积明显大于其余7批青翘药材有关。主成分分析结果显示，前3个主成分的累积方差贡献率为83.14%，即青翘和老翘全部化学成分信息的83.14%可由这3个主成分代表，其中第1主成分方差贡献率最大（为49.29%），青翘和老翘药材化学成分的相似性基本可以由其（第1主成分）包含的化学成分反映出来[26]。主成分得分图显示，L1～L6分布较近，Q2～Q6分布较近，Q7～Q8分布较近，而Q1分布较为独立，该结果与聚类分析一致。

综上所述，青翘和老翘的指纹图谱共有峰经相似度评价、聚类分析及主成分分析均有明显差异，所建HPLC指纹图谱可用于综合评价青翘和老翘药材的质量，可为连翘药材的质量控制及质量标准建立提供数据参考。

参考文献

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