殷晨星，李澎涛，于晓光，邢鹏，王娜，师楠，孟娜娜，王玉真

辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)近年来得到了很快发展。Palermo等[1]1992年首次报道了卵胞浆内单精子注射技术(intracy toplasmic sperm injection，ICSI)，在一定程度上解决了因男性因素导致的不育。随着显微外科技术的不断发展，Tournaye 等[2]1994年报道了使用睾丸精子抽吸术(testicular sperm aspiration,TESA)或经皮附睾精子抽吸术(percutaneous epidydimal sperm aspiration,PESA)取出的精子行ICSI，这些技术使梗阻性无精子症患者获得自己的遗传学后代成为可能。梗阻性无精子症是指由于输精管道的梗阻或者缺如使精子的运输发生障碍，精子不能随精液排出体外。梗阻性无精子症约占男性不育的1%，在无精子症中的发生率约为42%～48%[3-4]。

精子的发生是在睾丸、附睾内进行，完成了成熟和修饰过程，在时间和空间上非常严格，即不同来源的精子在畸形率、DNA碎片率、顶体完整性、成熟度等方面具有差异[5]。关于不同来源的精子对ICSI的受精结局和妊娠结局是否有影响，有很大争议。本文通过回顾性分析不同来源精子ICSI的受精和妊娠结局，旨在探讨不同来源精子及其DNA碎片率和顶体完整性对ICSI受精和妊娠结局的影响，从而对临床工作提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组

回顾性分析2017年5月至2020年5月于保定市妇幼保健院生殖医学科接受治疗的185个ICSI新鲜周期，按精子来源分为3组。A组：诊断为严重少弱精子症的男性患者的射出精液(95个周期)；B组：睾丸取精精子(57个周期)；C组：附睾取精精子(33个周期)。纳入标准：① 均为男方不育行ICSI，女方经检查无不孕因素，年龄≤35岁；② 女方体质量指数(body mass index,BMI)18～25 kg/m2；③ 血清卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，FSH)<10 mIU/mL；④ 双方没有染色体异常及Y染色体无精子因子(azoospermia factor,AZF)微缺失；⑤ 梗阻性无精子症的诊断：至少 3次体外排出精液经离心后显微镜检均未发现精子，诊断性手术取精可见成熟精子；⑥ 非圆头精子症患者。

1.2 研究方法

1.2.1 PESA和TESA方法 TESA主要采用局部麻醉结合睾丸穿刺活检获取睾丸组织，置入含1 mL体外操作液(G-mops Plus,Vitrolife)的培养皿中，用1 mL注射器针头将曲细精管切碎，倒置显微镜(×400)下，观察是否有精子。PESA采用常规精索局部麻醉结合注射器抽吸法获取附睾液，置入含1 mL体外操作液的培养皿中，倒置显微镜(×400)下，观察有无精子。若有精子，取精术结束，将培养液置入15 mL离心管中，300 g/min离心，去上清，留0.2 mL沉淀，重复再洗一次，常温备用。

1.2.2 促排卵方案 女方促排卵方案均为黄体期促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone analogue，GnRH-a)长方案：黄体中期(排卵后的5～7 d，一般为月经的第19～23 d)，给予短效GnRH-a(0.1 mg/d或0.05 mg/d，皮下注射)垂体降调节，降调节时间约14～16 d。降调节完毕后，测定体内性激素，B超检查双侧卵巢窦卵泡数及大小。开始启动促性腺激素(gonadotropin,Gn)，当至少有2～3个优势卵泡直径达18 mm，并参考黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)，停用GnRH-a、促排卵药，当晚肌注人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 IU，注射hCG 36 h后取卵。

1.2.3 精子DNA碎片指数的检测 采用精子染色质扩散试验。精子DNA 碎片指数(DNA fragmentation index,DFI)是较稳定的指标，DFI> 25%被认为是异常值。×400 倍显微镜下观察，根据光晕与精子头部横径的比例，光晕宽度大于精子头横径1/3，表示精子DNA完整无碎片；光晕宽度小于精子头横径1/3，表示精子DNA有断裂为碎片现象。精子DNA碎片率>25%视为异常。

1.2.4 精子顶体完整性检测 采用豌豆凝集素荧光标记法(fluorescein isothiocyanate conjugated pisum sativum agglutinin，FITC-PSA)，根据精子头部荧光的部位和形态来判断顶体完整性。精子远离颈部的头部约1/2以上荧光染色明亮且均匀，说明顶体完整；精子仅在赤道带出现荧光带，或顶体区没有荧光染色，说明已发生顶体反应；除上述两类精子外的所有精子为顶体异常精子。将精子顶体完整性<90%，视为顶体异常。

由于这3组来源的精子数量都比较少，所以取ICSI操作之后，将剩余含有精子的培养液离心，取精子沉淀，进行实验操作，至少计数精子100条。

1.3 相关分析指标

受精率=正常受精卵数/MⅡ卵数×100%；卵裂率=卵裂胚胎数/正常受精卵数×100%；优胚率=优胚数/2PN卵裂数×100%；临床妊娠率=妊娠周期数/移植周期数×100%。移植14 d后，检验血β-hCG，了解是否妊娠，6周后B超示可见孕囊确诊为临床妊娠。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 3组患者一般情况比较

共纳入185个新鲜移植 ICSI 周期。女方平均(29.1±2.8)岁，女方基础FSH平均值为(8.1±0.9)mIU/mL；3组在女方年龄、男方年龄、基础 FSH 水平、获卵数、移植胚胎数等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

2.2 3组精子DNA碎片指数、顶体完整性和助孕结局比较

B组DFI明显低于A组和C组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组顶体完整性比较差异无统计学意义(P>0.05)。A组、B组的2PN率高于C组，A组的2PN卵裂率、优胚率明显高于B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)；3组妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

3 讨论

不孕不育中约50%是男性因素[6]，其中主要包括严重少精子症、弱精子症及梗阻和非梗阻性无精子症等。在ART中，ICSI是治疗男性不育的一个重要有效手段。梗阻性无精子症患者可以通过PESA/TESA来获取附睾/睾丸精子。而不同来源的精子对ICSI后胚胎的发育和妊娠结局一直是临床工作者和胚胎学家关心的问题。解决这个问题需要追溯到精子的发生和精子相关分析。精子发生场所为睾丸的曲细精管，精子在睾丸形成过程中，经过了脱除细胞质和质膜重构等对受精至关重要的过程。精子膜重构决定了透明质酸酶和透明带受体的形成[7]。精子进入附睾后，在附睾内进一步成熟，获得一些功能，主要包括：精子的运动能力和受精能力等[8]。因此不同来源精子在功能相关方面可能存在差异，比如精子DFI和顶体完整性方面。

不同来源的精子对ICSI后胚胎发育和妊娠结局的影响争议不断，有学者认为睾丸精子的受精率、优胚率比附睾精子低，但附睾精子、睾丸精子及射出精子经过ICSI治疗后妊娠结局并无统计学差异[9-10]。有学者研究结果为睾丸精子组2PN受精率、卵裂率明显低于手淫精子组与附睾精子组，附睾精子组临床妊娠结局优于射精组及睾丸精子组，建议首选附睾取精[11]。还有学者研究认为对于梗阻性无精子症患者，睾丸精子和附睾精子行ICSI后可达到相似的妊娠结局，临床上可结合患者情况选择不同的取精方式[12]。而近期有一部分学者研究结果则证实睾丸精子较射出精子可获得更高的胚胎着床率、临床妊娠率和活产率[13]。最新研究认为睾丸精子组可移植胚胎明显高于附睾精子组，但治疗结局无差异[14]。

本文研究结果显示睾丸精子组的DFI显著低于重度少弱精子症患者手淫精子组(以下称“手淫精子组”)和附睾精子组。经过ICSI治疗后，手淫精子组和睾丸精子组的2PN率显著高于附睾精子组，差异有统计学意义，这与多数学者的结果不尽一致。

睾丸精子中有一些物质避免精子过度成熟[15]；精子DNA损伤多发生于睾丸后阶段，精子在附睾体中存留时间较长，导致精子活力下降，老化死亡精子较多，活性氧过多损伤精子DNA[16-17]。再加之梗阻性无精子症患者精子长时间在附睾中淤积阻滞，不利于附睾精子的成熟发育，而且梗阻性无精子症多为炎症引起的梗阻，附睾内炎性物质及氧化应激容易导致精子损伤，因此理论上睾丸精子 DNA损伤要小于附睾与精液中的精子[18-19]，本文结果也支持这一理论。精子DFI代表了精子基因的完整性和表观遗传学水平的正确性，直接影响了精卵是否能成功进行正常受精。这和本文中的睾丸精子组2PN率要高于附睾精子组的结果是一致的。而手淫精子组也高于附睾精子组，分析原因，可能是射出精子的成熟度要比附睾精子高。DNA损伤对后代安全性也有一定的影响[20]，有学者通过应用转基因小鼠-Big Blue这种公认的突变检测模型研究发现，精子DNA损伤对子代遗传及表观遗传的稳定性影响很大[21]。还有学者认为精子DFI与复发性流产具有显著相关性，复发性流产患者配偶DFI高于配偶无复发性流产史的生育男性[22]。

表1 3组患者一般资料比较

表2 3组DFI、顶体完整性和助孕结局比较[%(个)]

精子顶体完整性高除了在精卵自然结合过程中更有利于精子经过透明带与卵子完成受精反应外，在ICSI过程中还有利于精子通过发生钙离子激活反应激活卵子，从而完成受精[23]。目前关于顶体对辅助生殖结局影响的报道大部分是圆头精子症患者的案例，细胞内钙水平升高是精卵结合所必需的，然而圆头精子不能或者不能完全触发细胞内钙增加导致精子结合能力丧失或者降低[24]。ICSI可成功治疗圆头精子症，但受精率低，其原因可能是卵母细胞活化因子降低。本文中入选患者为非圆头精子症患者，且大多数注射进入卵母细胞的精子都是具有完整顶体的，排除了精子钙离子对卵子激活的影响。本研究显示顶体完整性在3组间差异无统计学意义，经过ICSI治疗后，手淫精子组和睾丸精子组的2PN率显著高于附睾精子组，差异有统计学意义。这说明，经ICSI治疗后，不同来源的非圆头精子对胚胎发育的影响不是由顶体完整性这个因素导致的。

本文中手淫精子组的2PN卵裂率、优胚率明显高于睾丸精子组、附睾精子组；睾丸精子组与附睾精子组相比，2PN卵裂率、优胚率差异都不明显。3组妊娠率比较差异无统计学意义。虽然手淫精子组2PN卵裂率、优胚率要高于睾丸精子组和附睾精子组，但最终的妊娠结局没有受到影响。这也可能跟样本数量有限、女方各种因素的差异性有关，我们期待今后收集更充分、有效的样本，做更科学、前瞻性的研究。

综上所述，ICSI选择不同来源的精子中，睾丸精子能达到手淫精子相似的胚胎发育和妊娠结局。如果不能得到手淫精子，由于睾丸精子DNA损伤要小于附睾精子，对后代的安全性可能更高；而且睾丸精子的正常受精率要高于附睾精子，因此可以优先选择睾丸精子行ICSI。