方超，张智明，李建华，何世民

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是猪的一种以腹泻、呕吐、后期脱水以至死亡为临床症状，由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、高度传染性肠道疾病。哺乳仔猪的死亡率高是本病的典型特征，死亡率可达到50%～100%，是危害养猪业的一种重要疾病[1-5]。2010年冬季以来，猪流行性腹泻出现变异株，导致PEDV CV777株疫苗免疫效果不理想，不能对免疫猪提供良好的保护，因此，开发猪流行性腹泻变异株疫苗有着十分迫切的现实意义[6-10]。

1 材 料

Vero细胞、MDBK细胞和PK-15细胞，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心传代保存；猪流行性腹泻ZF株F1代，由哈尔滨兽医研究所惠赠；DMEM细胞培养液，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自CLARK公司；胰酶，购自GIBCO公司；PBS溶液，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制保存；中和抗体效价≥1∶32的猪流行性腹泻阳性血清，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心制备、标定和保存；4～6周龄PEDV血清中和抗体阴性的断奶仔猪3头；牛病毒性腹泻病毒荧光抗体和猪瘟病毒荧光抗体，由哈尔滨兽医研究所惠赠；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 病毒培养和传代

2.1.1 细胞的复苏与传代

将冻存的Vero细胞从液氮中取出后，立即置于37℃水浴中快速融化。待细胞完全解冻后，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用吸管吸取新配置的细胞培养液，将沉淀轻轻悬起并分散均匀后转至含有10 mL细胞培养液的细胞培养瓶中，置37℃培养箱中培养36～48 h，观察细胞的生长情况，根据细胞的生长复苏状态，可在复苏后24 h进行1次换液。……