黄陆平 余绮旻 陈思佳 王均炉#

1 温州医科大学附属第一医院 浙江 温州 325000

2 浙江省台州医院 浙江 台州 318000

脓毒症是由于宿主对感染的反应失调，随着病原体刺激和促炎细胞因子释放，产生损伤微循环功能的全身炎症反应[1]。干扰素基因刺激蛋白（STING）是一种主要分布于内质网的蛋白，常由一些异常的DNA片段触发而激活，从而调控1型干扰素和促炎细胞因子的生成[2]。STING激活可以启动靶向活性自然杀伤细胞（TANK）结合激酶1（TBK1）的磷酸化和激动核因子κB（NF-κB）信号通路[3]。在本研究中建立脓毒症模型，采用电针干预，探讨其对肺损伤的影响和可能的相关机制。

1 材料和方法

1.1 小鼠脓毒症模型和实验分组：选取6～8周C57BL/6小鼠，购买于北京维通利华公司。小鼠腹腔注射脂多糖（LPS，10mg/kg）构建脓毒症模型，假手术组小鼠注射等量生理盐水。实验总共分为3组：假手术组、LPS组、LPS+电针组。

1.2 电针处理：小鼠腹腔注射LPS后1小时，开始电针处理。选取足三里和肺俞穴位，用韩式电针刺激仪连接针灸针刺激30min，频率2/15Hz，电流1mA。

1.3 HE染色：肺组织切片行HE染色。肺损伤评分指标为肺泡壁厚度、肺泡腔充血、血管出血和炎症细胞浸润情况：轻微损伤为损伤程度＜25%；中度损伤为损伤程度25%～50%；重度损伤为损伤程度50%～75%；极重度损伤为损伤程度＞75%。

1.4 肺干湿比检测：取小鼠右上肺叶，称量肺叶重量。接着把肺叶放在60℃烘箱中，72小时后取出称重，把刚取出的肺叶重量与从烘箱中取出的重量相比即为干湿比，用湿重/干重表示。

1.5 Western blot：取小鼠新鲜肺组织，加入RIPA、PMSF和蛋白磷酸酶抑制剂的混合液，用匀浆器匀浆，4℃ 10000rpm离心30min。取上清，用BCA试剂盒测各样本蛋白浓度。每个样本加入相同质量的蛋白电泳，后电转1.5小时转入PVDF膜，加入5%牛奶常温封闭2h，于一抗 STING（1∶1000，CST）、TBK1（1∶1000，CST）、磷酸化TBK1（P-TBK1，1∶1000，affinity）、NF- κB（1∶1000，CST）、磷酸化 NF-κB（P-NF-κB，1∶1000，affinity）中孵育过夜。第2天于二抗中孵育1小时。用ECL试剂盒曝光，蛋白表达量用Image Lab 6.0软件分析。

1.6 炎症因子检测：取小鼠血清，用ELISA试剂盒检测其α肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的表达水平。吸光度用多功能酶标仪检测。

1.7 统计学分析：统计使用SPSS 17.0软件分析。计量资料用-x±s表示。多组数据组间的差异性比较采用单因素方差分析Bonferroni检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色、干湿比和炎症因子观察急性肺损伤程度：正常小鼠肺组织HE染色显示肺泡壁薄且完整，LPS小鼠的肺组织炎症细胞浸润，肺泡壁厚且肺泡腔有出血。电针处理可以明显减轻肺损伤（P＜0.01），表现为肺泡壁轻度增厚，炎症细胞浸润减少，见图1。检测肺组织干湿比评估肺水肿程度，发现相比假手术组，LPS组的肺组织干湿比明显增加（P＜0.01）。电针处理减少LPS引起的肺水肿，表现为干湿比下降（P＜0.01），见表1。除此，结果显示相比假手术组，LPS组小鼠血清TNF-α和IL-6的水平明显增加（P＜0.01），电针处理可以减轻脓毒症小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6的释放（P＜0.05），见表1。

图1 小鼠肺组织HE染色

2.2 小鼠肺组织STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白表达比较：与假手术组相比，LPS组小鼠肺组织STING含量明显增高，下游相关蛋白P-TBK1/TBK1、PNF-κB/NF-κB的表达水平上升（P＜0.01），而相比LPS组，LPS+电针组小鼠肺组织STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB的蛋白表达水平明显下降（P＜0.05），见图2和表1。

图2 STING、P-TBK1、TBK1、P-NF-κB、NF-κB蛋白Western blot图

表1 肺损伤相关指标和肺组织STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白比较（±s）

表1 肺损伤相关指标和肺组织STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与LPS组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别假手术组LPS组LPS+电针组肺组织损伤评分0.67±0.82 7.33±1.21**5.17±1.17#相对干湿比1.00±0.05 1.22±0.07**1.08±0.05##TNF-α（pg/ml）65.72±6.90 149.08±13.39**123.85±16.79#IL-6（pg/ml）36.60±4.60 90.20±9.57**75.14±10.39#STING 1.00±0.39 2.70±0.54**1.94±0.50#P-TBK1/TBK1 1.00±0.09 1.98±0.28**1.55±0.26#P-NF-κB/NF-κB 1.00±0.11 1.89±0.19**1.56±0.21#

3 讨论

脓毒症引起的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征具有高发病率和高致死率。肺为娇脏，不耐寒热，而针刺可调血气、通经脉，减少肺气郁滞，使肺腑功能趋于平衡。肺俞为肺脏经气输注之处，有宣肺平喘之功效，能补益肺气、通利气机，而足三里具有补中益气、通经活络之功能，“肺俞-足三里”共同配伍使用频率高。有研究报道电针大鼠足三里穴位和肺俞穴位可以减轻体外循环引起的急性肺损伤[4]；而电针可以改善脓毒症大鼠的肠道机械屏障功能[5]。因此，本研究选取了足三里和肺俞，发现电针后处理可以减轻LPS小鼠肺组织炎症反应的形态学变化，减少肺组织水肿。脓毒症引起肺组织凋亡和细胞坏死，而STING可以通过感应凋亡或坏死的DNA来触发促炎细胞因子和干扰素的分泌进而加重组织的炎症反应。在脓毒症模型中，我们发现STING在肺组织的表达量大量增加，而电针足三里和肺俞可以减少脓毒症小鼠肺组织STING的表达和炎症反应。研究表明电针可以抑制脂多糖引起的脓毒症大鼠肺组织NF-κB的激活，减轻炎症因子释放[6]。而我们的实验中也证明了电针可以抑制TBK1磷酸化和NF-κB通路激活。

综上所述，电针可能通过调控STING及其下游相关蛋白TBK1和NF-κB信号通路的表达，减轻脓毒症的小鼠急性肺损伤，本研究为进一步完善电针治疗脓毒症肺损伤提供了理论基础。