陈志杰

(闽西职业技术学院 福建龙岩 364000)

黄酮类化合物具有多种显著的生理活性因而有着重要的药用价值。黄酮类化合物不仅可以防治心血管疾病，还有止咳、祛痰、抗菌的作用。目前国内研究还发现黄酮具有高效的抗自由基和抗氧化的作用，可以清除体内有害的氧化自由基并减少其对机体的损害，可以提高机体免疫能力，具有一定的抗癌能力[1]。

因而，黄酮作为一种天然的抗氧化性物质，近年来受到国内外广泛关注。由于人工合成的抗氧化剂具有潜在的毒性和致癌作用，寻找天然的抗氧化剂已经成为研究热点，其中寻找合适的植物来源一直是科技工作者关注的问题。

红花桑寄生(Scurrulaparasitica)是桑寄生科梨果寄生属半寄生植物。在福建境内，红花桑寄生产于诏安、尤溪、厦门、同安、永春、南靖、福州、永泰、南平及连城等地，常寄生于银杏、石榴、夹竹桃、桑、皂荚、朴树、泡桐、女贞、沙梨、桂花及栾树等30余种植物的树上[2]，其野生资源丰富。前期的研究表明红花桑寄生叶中含有丰富的黄酮醇类物质[3]。为此，作者以福建产的红花桑寄生的叶子为研究对象，提取红花桑寄生叶黄酮(SpLF)，并以猪油作为氧化基质研究探讨SpLF的抗氧化活性以及它与其它抗氧化性的协同作用，旨在为红花桑寄生叶黄酮的开发利用提供科学资料。

1 材料和方法

1.1 材料

样品：采自寄生于夹竹桃树枝上的红花桑寄生叶片，经烘干、粉碎后备用。

猪油：新鲜板油熬制，过滤后存于冰箱冷冻层备用。

1.2 主要试剂：2,6-二叔丁基对甲酚(简称BHT，化学纯)、茶多酚(简称TP、福州日冕科技公司提供)、槲皮素(简称QC，上海试剂二厂)、乙醇、石油醚、冰醋酸、三氯甲烷、硫代硫酸钠、碘化钾、硫代巴比妥酸、氢氧化钠、聚酰胺、可溶性淀粉、柠檬酸(CA)、维生素C(VC)等均为分析纯。

1.3 主要仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、粉碎机、旋转蒸发器、烘箱、恒温水浴锅、电子天平、二用紫外分析仪。

1.4 实验方法

1.4.1 红花桑寄生叶黄酮SpLF的制备

黄酮粗提液的制备：称取一定量的叶粉末加入适量乙醇(体积分数为80%～85%)于90 ℃水浴回流提取3次，每次2 h。经抽滤得滤液，经旋转蒸发器浓缩得浸膏。浸膏与少量聚酰胺粉拌合，烘干，以石油醚(沸程60～90 ℃)为溶液，用索式提取法去除浸膏的叶绿素等亲脂性杂质。

聚酰胺柱层析初步纯化SpLF：用湿法装柱，按每20 g聚酰胺粉上样0.2～0.5 g叶粉末，含25～40 g聚酰胺粉末(200目)，分别用浓度体积分数30%、60%、75%、90%、100%的乙醇进行分段洗脱。各管洗脱液取0.5 mL，控制PH5.5左右，加0.1 mL的体积分数10% AlCl3溶液，显色10 min后，在UV下于510 nm处[4]观察，合并在不同时间段洗脱出的具黄(绿)色斑点的洗脱液，用旋转蒸发器浓缩得浸膏，经真空干燥得SpLF，计算SpLF得率为4.65%左右。

SpLF得率=m/M

其中m=干燥的黄酮粉质量；M=红花桑寄生叶质量。

1.4.2 总黄酮含量的测定

采用三氯化铝室温显色法[5]，步骤如下：配制1 mg/mL SpLF溶液，取2.5 mL上述溶液，加入10 mL 0.1mol/L三氯化铝-甲醇溶液，充分振摇后，在λ 420 nm处测定A值，并以一系列标准浓度的芦丁作标样，制定标准曲线，从回归方程中计算总黄酮含量。

表1 SpLF协同增效因素水平表 %

1.4.3 SpLF对猪油抗氧化性实验

1.4.3.1 猪油油样的制备

取新鲜的熬制猪油50 g，共9份，其中一份作空白对照(CK)，其余8份分别加入猪油量的体积分数为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的SpLF和体积分数各为0.02%的BHT、TP、QC，置于(65±1)℃的恒温箱中进行抗氧化性试验，每2天测1次各样品中的POV值。

1.4.3.2 SpLF抗氧化协同增效试验

按三因素三水平设置9个实验组(见表1)，各加50 g猪油，其中一份作空白对照(CK)，置于(65±1)℃的恒温箱中进行抗氧化性试验，每2天测1次各样品中的POV值。

1.4.3.3 POV值的测定[6-7]

POV值是测定油脂酸败氧化的重要指标之一[8]。称取2～3 g的油样，置于250 mL碘量瓶中，加入20 mL冰醋酸与三氯甲烷混合液(V∶V=3∶2)，然后加入1mL饱和碘化钾溶液，立即加塞摇匀，置于暗处5 min。之后加50 mL水稀释，以质量分数为1%淀粉为指示剂。在不同日期用不同浓度的硫代硫酸钠溶液进行滴定，直到溶液颜色完全变白色澄清为止。并做空白实验对照(CK)。

POV值(%)=C×(V1-V2)×0.1269×100/M

式中：C=硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L)

V1=油样消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mol)

V2=空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mL)

M=样品质量(g)

1.4.3.4 MDA值的测定[6-7]

取油样各1mL，分别加入质量分数20%三氯乙酸1 mL，混匀放置20 min，再加入质量分数0.28%硫代巴比妥酸2 mL摇匀，沸水浴15 min，加入5 mL三氯甲烷，静置分层，取上清液于532 nm下比色。

抑制率=(Ack-At)/Ack

式中：Ack为处理油脂在532nm下的吸光值；At为对照油脂在532 nm下的吸光值。

2 结果与分析

2.1 不同洗脱浓度对SpLF得率的影响

为了验证乙醇洗脱浓度对SpLF得率的影响，设计了单因素试验，重复进行5次试验并进行方差分析。

表2 洗脱液不同浓度下的SpLF得率/%

从表2可以看出，乙醇洗脱液浓度为体积分数75%时，SpLF得率最高，平均可得4.65%。乙醇浓度较低时，得率也较低，因为低浓度乙醇洗脱能力较差，但是乙醇浓度高于75%后，得率反而开始降低，一方面因为高浓度的乙醇分子使黄酮叶细胞壁上的蛋白质发生变性凝固，使细胞内的黄酮类物质难以进一步溶出，另一方面过高的渗透压会使黄酮叶中的其它杂质溶出，反而使黄酮得率降低[9]。从表3的方差分析可以看出，乙醇浓度对SpLF得率具有极显著的影响，进一步验证了之前的SpLF得率数据的可靠性。

表3 方差分析表

2.2 SpLF标准曲线绘制

以一系列标准浓度的芦丁作标样，三氯化铝室温显色法[5]，制定标准曲线，得回归方程为y=1.9391x+0.0004，R2=0.9998(结果见表4、图1)。

表4 标准芦丁与吸光度(AlCl3显色法)

图1 芦丁AlCl3显色法A420 nm标准曲线

2.3 SpLF对猪油的抗氧化效果

本文的主要目的是研究来源于红花桑寄生的叶黄酮(SpLF)是否可作为高效的天然抗氧化物质。为此，作者以猪油为氧化基质测定SpLF是否可以防止猪油被氧化，然后测定其与其它抗氧化剂的协同抗氧化作用。

2.3.1 SpLF对猪油抗氧化作用

SpLF的抗氧化性可以用通过测定猪油的POV值来表示，越低的POV值表示抗氧化物活性越强。表5显示，猪油中添加了不同浓度的SpLF放置12 d后，其POV值均比未添加抗氧化剂的对照样品低，说明SpLF具有一定的抗氧化作用，且随添加量增加其抗氧化活性增强。 但是与其它已知抗氧化物质BHT、茶多酚(TP)、槲皮素(QC)比较后，发现SpLF的抗氧化性明显低于BHT、TP、QC等对猪油的抗氧化活性。因此红花桑寄生叶黄酮SpLF对猪油体系的抗氧化活性作用有限，原因可能与其在猪油中的溶解性有关。

表5 不同SpLF添加量的抗氧化实验效果(POV值/%)

2.3.2 SpLF的抗氧化协同效应

为了进一步研究SpLF的抗氧化功能，本文探讨其与已知抗氧化剂的协同作用。采用3因素3水平正交试验，在不同时间段，对不同组别测定POV值。表6表明，在对猪油的协同抗氧化作用中，几个因素之间的重要性分别是SpLF> BHT> VC，协同抗氧化的最佳组合是0.02% SpLF+0.03% BHT+0.02% VC，用该组合重复进行试验，其第10天的POV值只有1.263，对比空白组及其他组，显示出较强的协同抗氧化作用。从表7的方差分析中可以看出，三因素之间都还达不到显著差异水平，所以无需进行多重实验。

表6 SpLF抗氧化的协同效应 L9(34)正交试验

表7 正交试验结果方差分析

2.3.3 SpLF对猪油脂质过氧化的抑制作用

MDA是生物膜中多不饱和脂肪酸法师过氧化作用的最终产物之一，其含量可反映脂质过氧化作用的程度[10]，为了进一步研究SpLF对脂质过氧化的抑制作用， 本文继续测试了SpLF对猪油脂质的MDA生成量。结果发现SpLF对猪油脂质过氧化作用有一定的抑制作用，且随着SpLF添加量的增多，猪油脂质中MDA生成量相应降低，过氧化抑制率相应升高，其结果与其POV值的结果相一致。

表8 SpLF对猪油MDA生成量及抑制率的测定

3 结论

本研究表明了福建产的红花桑寄生叶中含丰富的黄酮类化合物，对猪油为氧化基质的底物有一定的抗氧化活性，且随添加量的增加而加强；同时与VC、BHT有一定的协同增效作用。但总体抗氧活性明显低于BHT、茶多酚及槲皮素的抗猪油氧化作用。原因可能与SpLF在猪油的溶解性有关，也导致其清除自由基的能力略低于抗坏血酸[11]。今后可尝试选择其他氧化基质，如小鼠肝、肾等进行脂质过氧化作用分析，以综合评价该叶黄酮的抗氧化作用及清除自由基的能力。今后还需要对SpLF的其他重要的药用价值进行更加系统研究。总之，本研究为更好地开发红花桑寄生的叶黄酮的药用价值和工业价值提供了科学指导。