梁小弟，梁小菊，李芙蓉，石茂才

(1.定西市人民医院骨二科，甘肃 定西 743000；2.西安交通大学附属红会医院小儿骨科，陕西 西安 710054；3.定西市人民医院麻醉科，甘肃 定西 743000)

骨关节炎是一种以关节软骨退化和关节炎症为特征的关节退行性疾病[1-2]。骨关节炎是由年龄、性别、肥胖、遗传等系统因素与局部因素相互作用的复杂结果[3-4]。软骨细胞负责细胞外基质的合成和周转，对关节功能至关重要[5]。Smad核相互作用蛋白1(Smad nuclear interaction protein 1，SNIP1)是一个抑炎蛋白，已有研究表明白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)处理可显著降低肠上皮细胞中SNIP1的表达，且SNIP1有助于降低肠上皮细胞的炎症反应[6]。在小鼠胚胎肾293细胞中，SNIP1抑制炎症通路NF-κB的表达[7]。过表达SNIP1还可以减弱了miR-335对骨肉瘤细胞的抑制作用[8]。本文主要目的是研究SNIP1对 IL-1β 诱导的骨关节炎软骨细胞的炎症反应及其分子机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人膝关节软骨细胞NHAC-κn(ATTC，美国)；DMEM-F12培养基(ThermoFisher，No.11320-033)；胎牛血清(Thermo Fisher，No.10099158)；脂质体3000(Invitrogen公司，美国)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(Takara，日本)；蛋白提取试剂盒(南京建成生物技术有限公司)；抗一氧化氮合酶(iNOS)抗体、抗环氧合酶-2(COX-2)抗体、抗Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)抗体、抗基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13，MMP-13)抗体、抗MMP-3抗体、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗体、抗磷酸化细胞核因子-κBp65(NF-κB p-p65)抗体、抗磷酸化核因子抑制蛋白(p-IκB)抗体、抗GAPDH抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)二抗 (稀释比为1∶5000)购自英国Abcam公司；ELISA检测试剂盒购自美国Abcam公司。

1.2 实验仪器 低温高速离心机和多功能酶标仪(Thermo Fisher，美国)，荧光定量PCR仪、分光光度计(Bio-Rad，美国)，凝胶成像系统(ABI，美国)，全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及处理：在DMEM细胞培养基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中培养NHAC-κn，将培养基置于含5% CO2的37 ℃培养箱中。按照 Lipfectamine 3000说明书，取对数生长期的NHAC-κn细胞进行转染。用IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)处理NHAC-κn 24 h构建骨关节炎细胞模型。NHAC-κn细胞被分为未处理组(untreated)、空白对照组(IL-1β)、空载体组(IL-1β+pcDNA3.1)、 过表达组(IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1)。

1.3.2 CCK-8法测定细胞活性：将转染成功的5×103/ml NHAC-κn细胞在96孔板上培养24 h后，在每个孔中加入10 μl CCK-8试剂，37 ℃培养4 h，用酶标仪检测450 nm的吸光度。

1.3.3 一氧化氮(NO)含量的测定：将细胞(3×105/ml)接种于6孔板培养，24 h后用Griess反应测定NO浓度。在543 nm波长下测量每个样品的吸光度。

1.3.4 RNA检测SNIP1表达：用TRIzol试剂将总RNA从软骨细胞中分离出来，并反转录成单链cDNA。采用10 μl PCR反应体系，包含4.5 μl稀释cDNA，0.25 μl正向引物，0.25 μl反向引物和5 μl SYBR Green Mix。引物序列物如下：SNIP1 F/R：5’-TGCGGTCTTTCAATATCGGC-3’，5’-AGAAGGTTCCATTGCCTGAGC-3’；GAPDH F/R：5’-GGGAAACTGCGGCGTGAT-3’，5’-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。GAPDH为内参基因。用 2-ΔΔCT法表示基因的相对表达量。

1.3.5 酶联免疫吸附试验(ELISA):采用ELISA法测定细胞培养上清液中一氧化氮(Nitric oxide，NO)，前列腺素E2(PGE2)，白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。具体实验方法如下：将特异性抗体用包被缓冲液稀释至最适浓度(1～10 μg/ml)，37 ℃水浴3 h。移去包被液，用洗涤缓冲液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。每孔加入0.2 ml含抗原的被检标本，37 ℃处理1～2 h。加入0.2 ml酶标记特异性抗体溶液，37 ℃处理1～2 h。移去包被液，用洗涤缓冲液(含0.05 %Tween-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 ml底物溶液于每个孔(OPD或OT)，室温作用30 min。加终止剂：每孔加2 M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。用酶标比色计测定OD(492 nm)值。以上实验重复3次，取平均值。

1.3.6 免疫印迹分析法蛋白表达：用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从软骨细胞中提取总蛋白， BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白在SDS-PAGE中被分离，然后被转移至PVDF膜并在含5%脱脂牛奶的TBST封闭缓冲液孵育2h。加入一抗(1∶1000稀释)在4 ℃冰箱中孵育过夜。次日，用含0.1% Tween-20的TBS洗涤3次，每次5 min，再与二抗(1∶5000稀释)一起孵育膜2 h。最后，用增强型化学发光试剂盒检测蛋白，并用Quantity ONE(BioRad, Hercules, CA, USA)软件进行定量。GAPDH作为内参蛋白。

2 结 果

2.1 IL-1β处理下调SNIP1表达 见图1。研究发现，24 h的IL-1β(0、5、10、20 ng/ml)处理明显降低NHAC-κn细胞活性(P<0.05，图1A)；SNIP1的mRNA和蛋白表达水平也随着IL-1β的浓度上升而下降(P<0.05，图1B、C)。鉴于20 ng/ml IL-1β处理组NHAC-κn活性过低，因此选择10 ng/ml IL-1β处理NHAC-κn细胞24 h进行后续相关实验。

2.2 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β诱导的NHAC-κn细胞中的炎症因子的表达 见图2。pcDNA3.1-SNIP1转染NHAC-κn细胞后，SNIP1表达显著提高(P<0.05)(见图2A﹑B)。利用ELISA法检测IL-1β诱导的NHAC-κn细胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α的含量，分析SNIP1对IL-1β诱导的NHAC-κn细胞中炎症反应的影响。过表达SNIP1的NHAC-κn细胞中NO、PGE2、IL-6、TNF-α含量均显著低于未转染组(P<0.05，见图2C～F)。

2.3 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β诱导的NHAC-κn细胞中iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5的表达 通过免疫印迹分析实验，表达SNIP1显著抑制IL-1β诱导的NHAC-κn细胞炎症反应中炎症介质(COX-2、iNOS)与分解代谢因子(MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5)的合成(P<0.05)，见图3。

2.4 pcDNA3.1-SNIP1促进IL-1β诱导的NHAC-κn细胞中Collagen Ⅱ和Aggrecan的表达 见图4。结果显示，IL-1β处理显著抑制NHAC-κn细胞外基质成分Collagen Ⅱ和Aggrecan的表达，过表达SNIP1可部分逆转IL-1β的抑制作用(P<0.05)。

2.5 pcDNA3.1-SNIP1抑制IL-1β诱导的NF-κB p65和 IκB 磷酸化 见图5。为探究SNIP1影响IL-1β诱导的NHAC-κn细胞的分子机制，我们用蛋白印迹法检测了p-p65、p-IκB的表达。pcDNA3.1-SNIP1显著抑制NF-κB通路，Betulinic acid可逆转pcDNA3.1-SNIP1对p-p65、p-IκB蛋白水平的抑制作用，且可缓解SNIP1对炎症因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用(P<0.05)。

注：与未处理组比较，*P<0.05

注：与未处理组比较，*P<0.05；与IL-1β+pcDNA3.1组比较，#P<0.05

3 讨 论

骨关节炎是一种慢性退行性关节疾病，其特征是软骨基质的逐渐丧失和关节软骨的破坏。随着时间的推移，软骨下骨增厚，滑膜内产生各种炎症介质，最后，膝关节韧带和半月板的退化导致关节囊肥大[9]。探索骨关节炎的治疗靶标对于改善患者的临床症状并提高其生活质量具有重要意义。

SNIP1在多种细胞和组织中均有表达，可调节不同的生物学进程[10- 11]。例如，SNIP1在炎性肠病患者的外周血单核细胞和固有层单核细胞中的表达均显著下调[12]。在活动性克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的黏膜上皮细胞中，SNIP1的表达也显著降低，并使肠上皮细胞屏障功能受损[6]。在本实验中，我们用10 ng/mlIL-1β处理NHAC-κn细胞24 h来构建骨关节炎的细胞模型，结果显示SNIP1的mRNA和蛋白的表达水平均下调。

注：与未处理组比较，*P<0.05；与IL-1β+pcDNA3.1组比较，#P<0.05

注：与未处理组比较，*P<0.05；与IL-1β+pcDNA3.1组比较，#P<0.05

注：与未处理组比较，*P<0.05；与IL-1β+pcDNA3.1组比较，P<0.05；与IL-1β+pcDNA3.1-SNIP1组比较，#P<0.05

IL-1β诱导iNOS产生过量的NO，从而刺激产生MMPs和PGE2等炎性细胞因子，并抑制胶原蛋白和蛋白多糖的合成[13]。PGE2能通过增强MMPs和其他炎性细胞因子活性介导软骨基质的降解[14]。越来越多的证据表明，抑制NO和PGE2等炎症介质的产生能够缓解骨关节炎[15]。在本研究中，我们发现过表达SNIP1显著抑制IL-1β诱导产生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5，并促进Collagen Ⅱ和Aggrecan的合成，表明SNIP1可能缓解IL-1β处理导致的软骨细胞炎性反应。

NF-κB信号通路是参与骨关节炎发病机制的主要分解代谢信号通路之一，在调节与骨关节炎相关的炎症介质中起着关键作用[16]。炎症介质如IL-1β刺激使NF-κB从细胞质进入细胞核，促进多种炎症相关基因(iNOS、COX-2、PGE2和MMPs)的表达上调，从而促进软骨细胞中产生分解代谢因子，导致软骨炎症[17]。在本实验中，我们发现过表达SNIP1抑制p-p65和p-IκB的表达，且NF-κB激活剂可逆转pcDNA3.1-SNIP1对炎症因子(IL-6、TNF-α)的抑制作用，提示SNIP1通过抑制NF-κB通路缓解软骨细胞的炎症反应。

本研究表明，在10 ng/ml IL-1β处理的NHAC-κn细胞中，SNIP1表达显著降低。过表达SNIP1会抑制炎症反应产生的NO、PGE2、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5水平，促进Collagen Ⅱ和Aggrecan合成。此外，SNIP1抑制NF-κB通路，NF-κB激活剂可以部分逆转SNIP1对骨关节炎的抑制作用。综上，SNIP1可能通过抑制NF-κB通路缓解骨关节炎，为探索骨关节炎的机理及治疗方法提供了理论基础。