王文婷 ，王彦珺 ，林向辉 ，林晓熙 ，李 伟 ，任 珅 *

（1.吉林农业大学中药材学院，长春130118；2.辽宁熙峰药业集团有限公司，桓仁117000）

原发性肝细胞癌在世界上作为一种最常见的恶性肿瘤， 已成为全球第三大与癌症相关的死亡的主要原因[1]。 肝癌治疗的选择取决于肿瘤的生物学行为，目前临床上治疗肝癌的方法众多，主要包括化学治疗、放疗和手术切除等[2]。近年来，大量科学研究表明，由天然产物衍生的药物具有高效、低毒的功效，因此被广泛应用于抗癌药物的使用[3]。

人参为五加科人参属Panax ginseng C.A. Meyer植物的干燥根及根茎， 是我国一种集药用和营养双重价值的传统中草药，享有“中华神草”“百草之王”等美誉，具有大补元气、补脾益肺等功效，久服可轻身延年、增强免疫功能[4-5]。近年来，人参的食用营养价值得到人们广泛关注，因此人参系列产品也随之产生，例如人参糖果、人参饮料等。 同时，通过利用人参精深加工得到的产品，来进一步提升人参的功效，增强机体免疫力，更符合现代“以食为养、以食为疗”的养生理念[6]。因此，开发人参功能性食品对于促进人参相关制品的深度开发具有显著的现实意义。

鲜人参膏（Fresh ginseng paste,FGP）是在原膏剂基础上引入的一种创新性的制备工艺，主要充分利用专利技术[7]，选用新鲜人参并利用其不同部位的加工方法，配以红枣精华，科学加工，转化稀有活性物质，成功富集出以 Rk1，Rg5，Rg3 为代表的 16 种稀有皂苷组分群，最大限度地保留了人参中所有活性成分和营养物质[6,8]，同时更富含精氨酸双糖苷AFG、氨基酸、多糖、人参蛋白等多种有益物质[9]。

人参加工产品因其富含人参皂苷并具有丰富的药理活性，是一种独特的药食兼具的开发品。本文以人参的现代研究背景， 初步探究人参新型加工品 “鲜人参膏”对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，以期为人参功能性食品的开发提供理论基础， 进一步丰富人参系列深加工产品的开发利用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 ICR 小鼠，SPF 级，5～6 周龄，体重 20～22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCXK（吉）2018-0007，自由饮水，适应性饲养 1 周后随机分成4 组，进行实验。

1.2 材料、试剂与仪器

小鼠H22肝癌细胞株， 购自中国科学院上海细胞所，经本实验室传代并保存；注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司；鲜人参膏（FGP），五星级产品，辽宁熙峰药业集团有限公司提供（SC10721052200667）；谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）试剂盒，购自南京建成生物工程有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）试剂盒，购自美国 R&D 公司。

VD-650 超净工作台，上海苏净实业有限公司；酶标仪Spectra Max Plus 384， 美国分子生物仪器公司；Neofuge 1600R 高速离心机， 上海力新仪器有限公司；Leica DM 500 显微镜， 德国徕卡有限公司；AL 104 电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 药物配制

准确称取鲜人参膏适量，加CMC-Na 混悬至所需给药浓度，按10 mL/kg 灌胃给药。 准确称取环磷酰胺（CTX）适量，用生理盐水配制成所需浓度，采用腹腔注射给药形式。

1.4 移植瘤动物模型建立

将腹水型小鼠肿瘤H22细胞置于37℃、5% CO2培养箱，用含10%FBS 的RPMI 1640 完全培养基悬浮培养。取最佳生长状态的小鼠肿瘤H22细胞，浓度调为5×106/mL，以 0.2 mL/只(1 ×106 个细胞/只)无菌注入雄性ICR 小鼠腹腔内，进行接种传代，于接种7d 左右，小鼠腹部膨隆，出现血性腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。 于无菌条件下抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，用无菌生理盐水稀释后，1500 r/min 离心10 min， 洗涤细胞3次，取0.2 mL 瘤细胞悬液接种到雄性ICR 小鼠的右肩皮下。

1.5 动物分组与给药处理

ICR 小鼠适应性饲养1 周，接种后第2d，小鼠随机分成共 4 组，即模型组（Model），阳性对照组（CTX,30 mg/kg），FGP 低剂量组（FGP-L, 300 mg/kg）和高剂量（FGP-H, 600 mg/kg）组，每组 10 只。 CTX 采用腹腔注射方式给药，FGP 组采用灌胃给药，模型组以等量的生理盐水代替，每日1 次，连续15d。 末次给药后禁食不禁水，16 h 后眼球取血断颈处死，收集血液及组织做相关分析。

1.6 抑瘤率和免疫器官指数测定

分别称取小鼠体质量、瘤质量，计算抑瘤率。 并称取脾脏、胸腺质量，计算脏器指数。 眼球取血后颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块，分离血清。

抑瘤率＝（模型组瘤质量－药物组瘤质量）/模型组瘤质量

胸腺（肝脏、脾脏）指数＝胸腺（肝脏、脾脏）质量／体质量

1.7 转氨酶与细胞因子测定

依照南京建成生物工程有限公司提供的试剂盒说明书， 采用微板法检测血清中肝功能指标， 包括ALT和AST。 依照试剂盒说明书，将小鼠血清稀释后，分别采用 TNF-α 和 IFN-γ 的 ELISA 试剂盒利用双抗体夹心法测定血清中二者含量。

1.8 统计分析

通过t 检验或利用SPSS 19.0 软件ANOVA 进行统计分析， 各项数据以 Mean ±SD 表示， 用 GraphPad Prism 8.0.4 软件进行方差分析并绘图。 P＜0.05 或P＜0.01 认为有统计学差异。

2 结果

2.1 对H22 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

结果表明：模型组小鼠状态萎靡，毛色暗淡，FGP给药组小鼠状态改善明显， 较为活泼。 由表1 可知，CTX 组及FGP 低、高剂量组的平均瘤质量均显著低于模型组（P＜0.05），且 FGP 低、高剂量组的平均瘤质量显著高于 CTX 组（P＜0.05）；肿瘤抑制率以 CTX 组达到最高，为60.18%，FGP 高、低剂量组次之。

表1 FGP 对H22 移植瘤小鼠肿瘤生长的影响 （n=10,Mean±S.D)Table 1 The effect of FGP on tumor growth of H22 transplanted tumor mice(n=10,Mean±S.D)

2.2 对H22 荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

结果表明：如表2 所示，与模型组相比，CTX 组胸腺指数显著下降 （P＜0.05），FGP 低、 高剂量组与 CTX组相比显著升高（P＜0.05）。 CTX 组的脾脏指数明显低于模型组 （P＜0.05）， 随着 FGP 给药剂量的增加，与CTX 组相比，脾脏指数显著升高（P＜0.05）。

表2.FGP 对H22 移植瘤小鼠免疫器官指数的影响（n=10,Mean±S.D)Table 2.The effect of FGP on immune organ index of H22 transplanted tumor mice(n=10,Mean± S.D)

2.3 对H22 荷瘤小鼠肝功能的影响

如图1 所示， 与模型组比较，CTX 组小鼠血清中ALT 和 AST 的水平显著升高 （P＜0.05）， 与 CTX 组相比，FGP 低、 高剂量组能够明显抑制血清中 ALT 和AST 水平的升高（P＜0.05），初步证明了 FGP 对 H22荷瘤小鼠肝功能具有一定的保护作用。

图1 FGP 对H22 荷瘤小鼠肝功能ALT 和AST 的影响（n=10,Mean±S.D）Fig.1 The effect of FGP on ALT and AST of liver function in H22 tumor-bearing mice e(n=10,Mean ±S.D)

2.4 对H22 荷瘤小鼠相关细胞因子的影响

由图2 所示， 与模型组相比，CTX 组小鼠血清中TNF-α 和 IFN-γ 含量明显增高，差异显著（P＜0.05）；与CTX 组相比，FGP 低、 高剂量组小鼠血清中TNF-α水平显著升高；小鼠血清中IFN-γ 水平随着FGP 给药剂量的增加也随之增加，其中FGP 高剂量组与模型组相比显著升高。

图 2.FGP 对 H22 荷瘤小鼠细胞因子 TNF-α 和 IFN-γ 水平的影响（n=10,Mean ± S.D）Fig.2.The effect of FGP on the levels of cytokines TNF-α and IFN-γ in H22 tumor-bearing mice(n=10,Mean ± S.D)

3 讨论

近年来， 原发性肝细胞癌的病死率已居我国恶性肿瘤中的第二位[10]，因此引起人们的广泛关注，该研究结果表明，FGP 能够有效抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长，增强其肿瘤抑制率，具有一定的抗肿瘤作用。 当机体受到损伤时，其脏器质量和指数发生改变。在本研究中，随着FGP 给药剂量的增加，脾脏指数明显下降，且与CTX 组相比具有显著性；FGP 低、 高剂量组与CTX组差异显著，说明FGP 可以有效的对荷瘤小鼠的免疫脏器发挥保护作用。

血清中ALT 和AST 水平是反应肝功能的两个重要指标，当机体肝功能受到损伤时，两者水平会显著升高[11]。 本研究通过建立H22皮下移植瘤模型小鼠，并通过CTX 腹腔注射给药及FGP 灌胃给药的方式探讨其抗肿瘤作用。 结果显示，与模型组相比，CTX 组小鼠血清中的ALT 和AST 水平均显著升高；与CTX 组相比，FGP 低、高剂量组小鼠血清中ALT 和AST 水平均有明显的降低， 表明肝损伤的程度被明显改善， 说明FGP对H22荷瘤小鼠起到一定的抗肿瘤作用。

大量研究表明， 肿瘤的发生与机体免疫功能下降及失调有关，CTX 作为临床上常用的一种广谱抗肿瘤药物，主要通过免疫抑制来发挥抗肿瘤作用[12]。 在治疗过程中， 与模型组比较，CTX 组小鼠肿瘤平均质量显著下降，胸腺指数及其脾脏指数也显著降低。脾脏是一种重要的机体免疫器官， 胸腺是T 淋巴细胞分化成熟的场所，当恶性肿瘤发生是，T 淋巴细胞会增殖分裂释放出多种细胞因子， 细胞因子在机体内起到相互促进或相互抑制的作用，从而来调节机体的免疫系统，同时作为评价机体免疫功能的重要指标[13]。 TNF-α 是一种促炎因子， 能够直接杀死肿瘤细胞且对正常细胞不产生明显的毒害作用的一种细胞因子[14]。 FGP 可以使小鼠血清中TNF-α 水平显著上升，可能是通过增加血清中肿瘤坏死因子的含量从而增强机体的抗肿瘤作用。IFN-γ 主要由活化的Th 细胞和NK 细胞产生，能够促进Th1 细胞发育并且抑制Th2 细胞活化与增殖，刺激B 细胞产生的抗体类型向调理素方向转变， 具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调控的作用[15]。FGP 可以使小鼠血清中IFN-γ 水平明显升高，说明FGP 是通过促进机体产生免疫因子增强其抗肿瘤作用。

综上所述，FGP 对H22荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用，其抑制肿瘤作用可能与增强机体免疫力，保护机体肝功能受损及升高血清中TNF-α 和IFN-γ 水平有关。 此外，与CTX 组相比，FGP 的抗肿瘤作用较好，并且其毒性较低。 该研究阐述了FGP 对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用， 初步揭示了鲜人参膏能够通过抑制肿瘤生长达到保护作用，具有预防肿瘤发生的作用，为人参及相关产品的深度开发提供理论依据。