蔡 伟 ，李 敏 ，施亚宁 ，李兆慧 ，陈梦婷 ，何 欣 ，罗益远 *

（1.浙江医药高等专科学校中药学院，宁波315100；2.吉林农业科技学院中药学院，吉林132101）

广金钱草为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分[1]，传统的中药材，别名又为落地金钱、铜钱草、马蹄香。在采集广金钱草时通常在夏季和秋季采割其干燥的部分， 除去其本身的杂质，并晒干。大多分布在我国的福建省、广西省、湖南省等地。 具有甘、淡、凉的性味,并具有清热利湿、通淋排石的功效[2-6]。

广金钱草中黄酮类化合物的提取方法有超滤法、热回流法、超声波提取法、水提法、微波提取法等。纤维素酶在现实生活中有着很广泛的运用， 是一种辅助作用性能很强的水解纤维素复合酶， 使用水酶法可以降低消耗、并且能够减少化学试剂的用量，使得实验条件和环境温和的优点， 已广泛运用于中草药主要成分的提取研究中[7-10]。 本次试验是通过超声波提取法，又以纤维素酶来进行辅助，本试验以广金钱草为原料，采用纤维素酶协同超声波提取法进行变量对比实验对广金钱草中总黄酮的提取工艺进行筛选。 旨在为广金钱草药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考，为广金钱草的进一步研究提供技术基础。

1 仪器与试药

ALC-310.3 型电子分析天平 （奥豪斯仪器有限公司）；742W 型紫外可见分光光度计 （上海奥谱勒仪器有限公司）；KQ-700v 型超声波清洗器（济宁天华超声电子仪器有限公司）；80-11 型离心机 （长沙东旺实验仪器有限公司）；芦丁（批号：0080-9705，购于中国药品生物制品检定所）、纤维素酶（≥50U/mg）、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、无水乙醇等（以上试剂均为分析纯）。

试验广金钱草药材样品为2019 年实地采集，药材采集后净制干燥，即的。所有样品均鉴定为豆科植物广金钱草 Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。 留样保存于吉林农业科技学院药物分析实验室。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的制备

精确称取芦丁标准品至容量瓶中， 用体积分数50%乙醇溶液配制0.020mg/mL 的芦丁标准溶液。分别取 5 个 10mL 容量瓶， 加入芦丁标准液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL， 分别加入50%无水乙醇使各溶液都是5mL，各加入 0.3mL5%Na2NO2溶液，摇匀静置 5min 后加10%Al (NO3)3溶液 0.3mL， 摇匀静置 5min 后再加2mL4%NaOH 溶液，摇匀，最后用50%无水乙醇定容，静置15min。 以对应试剂为空白，对不同浓度的芦丁标准液在510nm 下扫描测定其吸光度值A，以浓度C 为横坐标，吸光度A 值为纵坐标，绘制标准曲线（图1），得回归方程为：Y=8.6116X+0.0007 相关系数 R2=0.9997。

图1 芦丁标准曲线

2.2 提取工艺流程

超声波辅助法提取广金钱草中黄酮总含量的工艺流程： 广金钱草叶粉末→加入适量纤维素酶→破壁水解→煮沸，使酶灭活→乙醇浸提，超声波处理→离心→收集上清液→定容→待测。

2.3 单因素试验

2.3.1 不同料液比对广金钱草总黄酮含量影响

准确称量10g 广金钱草粗粉5 份，加入750mg 纤维素酶，在40℃的条件下酶解15min。反应后将其煮沸5min，使酶灭活，静置。 料液比分别为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 等 5 个水平进行提取， 乙醇浓度为 50%，超声波提取50min，离心取上清液，定容至刻度待测，测定吸光度，结果见图2。 不同料液比情况下提取广金钱草中黄酮总含量试验进行方差分析，结果见表1。

图2 料液比对广金钱草中提取黄酮总含量的影响

表1 料液比的单因素方差分析

由上表 1 可知，F=47.804，P＜0.05 且 P＜0.01， 因此可以认为5 种不同料液比对提取广金钱草中黄酮总含量差异极显著。 对其做多重比较，结果见表2。 由上表2 可知当 α=0.01 时， 料液比 1∶40、1∶50、1∶10 之间均无显著性差异。 料液比1∶20 与其他各水平之间均有显著性差异。 料液比1∶30 与其他各水平均有显著性差异，在料液比达到1∶30 的情况下总黄酮含量达到峰值。 为了进一步考察料液比对黄酮总含量提取的效果的影响，选择料液比 1∶20、1∶30、1∶40 作为正交试验水平，进行正交试验。

表2 料液比的多重比较

2.3.2 酶解温度对广金钱草总黄酮含量的影响

准确称量10g 广金钱草粗粉5 份，加入750mg 纤维素酶，酶解温度设置在 30、35、40、45、50℃的条件下酶解15min。反应后将其煮沸5min，使酶灭活。在料液比为 1∶30，50%乙醇，超声波提取 50min，离心，取上清液定容，测定吸光度，结果见图3。 不同酶解温度情况下提取广金钱草中黄酮总含量试验进行单因素方差分析见表3，结果显示P＞0.05，因此该因素分析无意义。

图3 酶解温度对广金钱草提取黄酮总含量的影响

表3 酶解温度的单因素方差分析

2.3.3 超声时间对广金钱草总黄酮含量的影响

准确称量10g 广金钱草粗粉5 份，加入750mg 纤维素酶，在40℃的条件下酶解15min。反应后将酶液煮沸 5min，使酶灭活，静置。料液比为 1∶30，50%乙醇浓度为， 超声时间分别在 10、30、50、70、90min 的条件下进行上述试验，然后离心，取上清液定容，测定吸光度，结果见图4。 不同超声波时间情况下提取广金钱草中黄酮总含量试验进行单因素方差分析见表4。

图4 超声时间对广金钱草黄酮总含量的影响

表4 超声波提取时间的单因素方差分析

由表 4 可知，F=31.484， 其显著值 P＜0.05 且 P＜0.01,因此可以认为5 种不同超声波提取时间对提取广金钱草中黄酮总含量差异极显著。再对其做多重比较，结果见表5。 当超声波时间为90 和10min 时，二者之间均无显著性差异，超声波时间为10 和30min 时差异较显著，超声波时间为30 和70min 时，二者之间均无显著性差异， 超声波时间为50min 时与其他各水平之间均有显著性差异， 此时黄酮总含量达到峰值， 选择30、50、70min 作为正交试验水平，进行正交试验。

表5 超声波提取时间的多重比较

2.3.4 乙醇浓度对广金钱草总黄酮含量的影响

准确称量10g 广金钱草粗粉5 份，加入750mg 纤维素酶，在40℃的条件下酶解15min。反应后将酶液煮沸 5min，使酶灭活，静置。 料液比为 1∶30，乙醇浓度分别为为 30%，40%，50%，60%，70%， 超声提取 50min，然后离心，取上清液定容，测定吸光度，结果见图5。 不同乙醇浓度情况下提取广金钱草中黄酮总含量试验进行单因素方差分析见表6。

图5 乙醇浓度对广金钱草黄酮总含量的影响

表6 乙醇浓度的单因素方差分析

由表 6 可知，F=22.845， 其显著值 P＜0.05 且 P＜0.01,因此可以认为5 种不同乙醇浓度对提取广金钱草中黄酮总含量差异极显著。再对其做多重比较，结果见表 7。 由上图可知当 α=0.05 和当 α=0.01 时，乙醇浓度为40%、70%和60%时此三个水平之间均无显著性差异， 且与其他水平之间有显著性差异， 乙醇浓度为30%和乙醇浓度为50%时两个水平之间存在显著差异。 在乙醇浓度为50%的情况下黄酮总含量达到峰值， 因此选择乙醇浓度为40%、50%、60%的两个水平作为正交试验水平，进行正交试验。

表7 乙醇浓度的多重比较

2.3.5 纤维素酶含量对广金钱草总黄酮的影响

准确称量10g 广金钱草粗粉5 份， 选用纤维素酶分别为 250、500、750、1000、1250mg，在 40℃的条件下酶解15min。反应后将酶液煮沸5min，使酶灭活，静置。料液比为1∶30，50%乙醇，超声提取50min，取上清液定容，测定吸光度，结果见图6。 不同纤维素加酶量情况下提取广金钱草中黄酮总含量试验进行单因素方差分析见表8。

图6 加酶量对广金钱草黄酮总含量的影响

表8 加酶量的单因素方差分析

结果显示，F=5.292，其显著值P＜0.05,因此可以认为5 种不同纤维素酶含量对提取广金钱草中黄酮总含量差异显著。 再对其做多重比较见表9，当纤维素酶含量为250、500 和1250mg 时， 三者之间均无显著性差异，纤维酶含量为500、1250 和1000mg 时三者之间均无显著性差异， 纤维素酶含量为1000 和750mg 时互相无显著差异。 选择其及其最近两段水平即纤维素酶含量为 500、750、1000mg 时作为正交试验水平， 进行正交试验。

表9 加酶量的多重比较

2.4 正交试验

通过单因素试验结果，选以纤维素酶、乙醇浓度、超声波时间和料液比4 个因素为主要考察因素。 通过L9（34）的正交设计，以黄酮总含量为指标进行试验，取9 份广金钱草粉末，按照因素水平表（表10）的设计条件进行试验。 正交试验结果见表11。

表10 广金钱草水提工艺因素水平表

表11 正交试验表及试验结果

以黄酮总含量为指标，极差R 分析表明，四个因素影响广金钱草中提取黄酮总含量的主次关系依次是乙醇浓度（C）＞料液比（A）＞纤维素酶（B）＞超声波提取时间（D）。 正交试验结果推定C2A2B1D1为最佳提取条件，即乙醇浓度 50%、料液比 1∶30，纤维素酶 500mg，超声波提取时间30min。

2.5 优化工艺的重现性试验

为进一步验证工艺的稳定， 准确称量10g 广金钱草粗粉，加入浓度50%乙醇、料液比1∶30，纤维素酶500mg，超声波提取时间30min。重复试验3 次，计算相对标准偏差，验证最佳的提取工艺，结果见表12。 结果表明，3 次试验中总黄酮含量平均为2.28%，RSD 值为0.95%。 验证结果表明该工艺稳定可行。

表12 验证试验结果

3 小结

本试验以广金钱草为原料， 采用纤维素酶协同超声波提取法进行变量对比实验对广金钱草中总黄酮的提取工艺进行筛选。 所得工艺合理，抗氧化活性较高，为鱼腥草的进一步研究提供技术基础。