常 盼,李 静,张 静,陈伟国,王西辉#,于 军*

(1西安医学院第二附属医院中心实验室,西安 710038;2陕西省心血管内科疾病临床医学研究分中心;*通讯作者,E-mail:pclamper@163.com;#共同通讯作者,E-mail:xixiwang63@126.com)

近年来,糖尿病发病率急剧增高,成为仅次于心脑血管疾病和癌症的又一大疾病,严重危害人类健康[1]。糖尿病引起的心肌特异性病变是导致糖尿病病人致残和致死率增高的主要原因[2],由糖尿病引起的心肌特异性疾病,在没有发生其他血管病变的情况下,称为糖尿病性心肌病,由于糖尿病性心肌病的病理生理学尚未完全了解,可能涉及多种机制,包括氧化应激、炎症、心肌纤维化、内质网应激和凋亡性细胞死亡等,这些也被认为是糖尿病性心肌病发病机制的潜在促成因素[3,4]。目前糖尿病性心肌病并没有有效的治疗策略,我们前期研究表明,抑制氧化应激和凋亡可能是保护大鼠糖尿病心肌损伤的主要机制[5]。而氧化应激和凋亡的发生往往与内质网应激密切相关。有报道称,有氧运动可提高心肌胰岛素敏感性,对肥胖人群和糖尿病患者的心脏功能具有重要的改善作用,是预防和治疗糖尿病及其并发症的重要且有效的非药物干预措施[6]。然而,目前有氧运动对糖尿病心肌损伤的保护机制仍不是很清楚,本研究主要探讨有氧运动对小鼠糖尿病心肌损伤的心脏保护作用,以及其对氧化应激和内质网应激的影响,并探讨相关的作用机制。

1 材料和方法

1.1 试剂

链脲菌素(STZ)购自美国Sigma公司;心肌肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒购自威海纽普生物技术有限公司;肌酸激酶(CK-MB)活性检测试剂盒购自美国Sigma公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司;GRP78、CHOP、PKG及β-actin购自美国CST公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物有限公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;环鸟苷酸(cGMP)酶联免疫检测试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 实验动物与分组

8周龄C57BL/6J雄性小鼠40只购自空军军医大学实验动物中心,饲养于西安医学院第二附属医院中心实验室,室内温度23-25 ℃,相对湿度40%-60%,自由饮水和摄食。随机分为正常对照组(Con),糖尿病心肌损伤组(DCM)和糖尿病心肌损伤+游泳运动组(DCM+E)。糖尿病心肌损伤组和糖尿病+游泳运动组小鼠腹腔注射50 mg/kg STZ溶液(注射前用pH为4.5的0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液避光配制,现配现用),连续注射5 d,注射完1周后进行小鼠血糖检测,以空腹血糖大于16.7 mmol/L为标准,且伴有“三多一少”症状,视为糖尿病小鼠模型构建成功。继续喂养12周后诱导糖尿病心肌损伤模型[7]。糖尿病+游泳运动组,糖尿病小鼠造模成功4周后,给予8周的游泳运动训练。

1.3 有氧运动训练

有氧运动训练采取游泳运动训练,先进行1周的适应性运动训练后进行8周的游泳运动训练,运动方案为每天游泳60 min,运动组的动物在32-35 ℃的水中进行无负重游泳运动,5 d/周,持续8周。小鼠在第1天游泳15 min,游泳时间逐渐增加,在1周内累积至60 min/d。所有运动时间均在上午8点到11点之间进行,此过程参考已经发表的有关文献[8,9]。

1.4 超声心动图检测小鼠心脏功能

使用连续超声Vevo 2100系统采用非侵入性的方法检测小鼠心功能。用3%异氟烷麻醉小鼠,脱毛膏去除小鼠胸前毛发后,利用1%异氟烷维持小鼠麻醉状态,通过调整探头方向,使可清晰显示出小鼠心脏的心尖部位、三腔部位、四腔部位、五腔切面及左室长轴等切面。通过手持操纵超声换能器获得2D和2D引导M模式的超声心动图,测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)。所有超声心动图像均使用Vevo 2100分析软件进行分析。

1.5 血浆cTnI及CK-MB的检测

收集各组小鼠血浆,根据检测试剂盒说明书进行操作,采用全自动免疫发光分析仪检测血浆中cTnI和CK-MB的含量。

1.6 心肌组织中氧化应激MDA、SOD及GSH的检测

取各组小鼠左室相同部位心肌组织,提取蛋白,根据南京建成生物公司提供的ELISA试剂盒说明书,采用酶标仪检测各组心肌组织MDA、SOD及GSH的含量。

1.7 心肌组织cGMP的含量检测

称取各组小鼠相同部位的心肌组织块,进行蛋白裂解,根据生工生物工程有限公司的ELISA试剂盒说明书进行操作,采用酶标仪检测各组心肌组织中cGMP的含量。

1.8 Western blot检测目的蛋白含量

动物处理完后,提取组织蛋白,通过BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品,采用恒流250 mA,120 min的条件将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶常温封闭2 h,一抗GRP78、CHOP、PKG及β-actin(1 ∶1 000)在4 ℃孵育过夜。二抗1 ∶3 000室温孵育2 h,ECL化学发光系统检测免疫印迹。

1.9 统计学分析处理

2 结果

2.1 有氧运动对小鼠糖尿病心肌损伤的影响

首先采用小动物超声检测左心功能,结果发现,与Con组相比,DCM小鼠心脏功能显著降低(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组的小鼠心脏功能增加(P<0.01,见图1)。通过检测心肌损伤的标志物cTnI及CK-MB,结果显示,与Con组小鼠相比,糖尿病小鼠血浆cTnI及CK-MB含量显著增加(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组心肌组织的cTnI含量及CK-MB含量显著降低(P<0.01,见图1)。

与Con组相比,**P<0.01;与DCM组相比,##P<0.01图1 各组心肌损伤的比较Figure 1 Comparison of myocardial damage between three groups

2.2 有氧运动对小鼠糖尿病心肌组织氧化应激的影响

与Con组相比,DCM小鼠心肌组织的MDA和GSH含量显著增加(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组小鼠心肌组织中MDA和GSH含量降低(P<0.05,,见图2)。与Con组相比,DCM小鼠心肌组织中SOD含量显著降低(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组小鼠心肌组织中SOD含量增加(P<0.05,见图2)。

2.3 有氧运动对内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的影响

与Con组相比,DCM小鼠心肌组织中GRP78和CHOP的表达含量显著增加(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组小鼠心肌组织中GRP78和CHOP的表达含量显著降低(P<0.01,见图3)。

2.4 有氧运动对小鼠糖尿病心肌损伤cGMP-PKG信号通路的影响

为了探究游泳运动对小鼠糖尿病心肌损伤作用的机制,分别检测心肌组织cGMP含量以及蛋白PKG的水平,结果见图4。与Con组相比,DCM小鼠心肌组织中cGMP含量及PKG的蛋白水平显著降低(P<0.01);与DCM组相比,DCM+E组小鼠的心肌组织cGMP水平及PKG的蛋白水平增加(P<0.05)。

与Con组相比,**P<0.01;与DCM模型组相比,#P<0.05图2 各组心肌氧化应激的比较Figure 2 Comparison of myocardial oxidative stress between three groups

与Con组相比,**P<0.01;与DCM模型组相比,##P<0.01图3 各组心肌内质网应激的比较Figure 3 Comparison of myocardial endoplasmic reticulum stress between three groups

与Con组相比,**P<0.01;与DCM模型组相比,#P<0.05图4 各组心肌组织中cGMP和PKG的含量比较Figure 4 Comparison of the contents of myocardial cGMP and PKG between three groups

3 讨论

糖尿病心肌损伤作为糖尿病的重要并发症,最终可导致患者心力衰竭和死亡,严重影响糖尿病患者的生活质量,增加社会和经济负担。糖尿病心肌损伤发病缓慢,早期即可出现结构和功能的异常,左心室肥大、心肌纤维化、舒张功能障碍等[10]。在本研究中,采用小动物超声检测左心室射血分数评价心脏功能,结果发现,糖尿病小鼠心脏功能受损,而有氧运动缓解糖尿病小鼠心脏功能受损,为了探究有氧运动对糖尿病小鼠的心脏保护效应,分别检测血浆中cTnI以及CK-MB的含量,结果显示,有氧运动降低糖尿病心肌损伤小鼠血浆中cTnI以及CK-MB的含量。以上结果提示,有氧运动能缓解糖尿病心肌损伤小鼠的心肌损伤,对糖尿病心肌损伤小鼠具有心脏保护作用。

氧化应激通过产生过氧化反应,从而对组织产生损伤。由于心肌作为代谢活性很高的组织,其抗氧化能力低于其他组织,所以容易受到过氧化物、超氧化物等自由基的损伤。高糖可升高氧化应激,下调抗氧化能力[11]。有文献报道,跑台运动训练改善糖尿病大鼠心肌损伤的重要机制可能是通过抑制氧化应激NADPH氧化酶表达和活性实现的[12]。耐力运动训练可提高2型糖尿病大鼠NO活性[13],3周低脂饮食联合有氧训练提高心肌细胞数量,减少心肌细胞脂质的积累,同时伴有NO活性的增加,主要是由于SOD参与调节NO与过氧亚硝酸盐的平衡[14]。在本次研究中,通过检测氧化应激MDA、SOD及GSH的相关指标,结果发现有氧运动抑制糖尿病心肌损伤小鼠心肌组织MDA和GSH的活性,提高SOD的活性。以上结果进一步表明,有氧运动对糖尿病心肌损伤具有重要的保护作用,抑制氧化应激可能是防治糖尿病心肌损伤的主要策略之一。

不断增加的氧化应激会进一步引起细胞凋亡和内质网应激的发生[15]。内质网作为维持细胞内环境稳态的主要细胞器之一,在参与蛋白质合成、折叠、成熟,脂质合成及Ca2+稳态等方面发挥重要的生物学作用[16]。持续的高糖导致内环境稳态失衡,引起细胞内质网应激的发生,越来越多的研究表明,内质网应激的发生与糖尿病心肌损伤密切相关[17]。内质网主要有3种跨膜蛋白,分别是需肌醇酶1(IRE-1)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、活化转录因子6(ATF6),这3种跨膜蛋白在正常情况下与内质网应激的分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合处于非活化的连接状态,当内质网稳态失衡时,GRP78与3种跨膜蛋白IRE-1、PERK和ATF6解离,激活内质网应激相关信号通路[18,19]。本次研究中,检测内质网应激相关蛋白GRP78的表达,结果显示,糖尿病心肌损伤小鼠心肌组织GRP78的含量显著增加,而有氧运动可抑制GRP78的表达。有报道显示,抑制GRP78的mRNA转录水平可保护糖尿病大鼠心肌损伤[20]。CHOP是凋亡途径的下游蛋白,其在内质网应激诱导的细胞凋亡中起重要作用,持续增加的氧化应激和内质网应激可导致细胞凋亡的发生[21]。通过检测糖尿病心肌损伤小鼠心肌组织CHOP的表达情况,结果显示有氧运动训练可缓解CHOP的增加。以上结果提示,糖尿病心肌损伤小鼠心肌组织内质网应激增加,内质网应激相关的凋亡也显著增加,而有氧运动训练可缓解内质网应激,内质网应激可能是糖尿病心肌损伤的主要病理生理机制。

第二信使介导的信号通路,严重影响糖尿病心肌损伤的正常生理功能[22]。为了进一步探究有氧运动训练对糖尿病心肌损伤的保护机制,本次研究检测第二信使介导的cGMP-PKG信号通路。课题组前期研究[23]发现,在高糖/高脂的心肌细胞中,通过给予外源性的钠尿肽,可激活cGMP-PKG信号通路,进而抑制内质网应激的发生。有研究显示,心血管合并症不断加剧导致全身性炎症增加,氧化应激增强,最终导致cGMP通过多种途径降解,从而降低了PKG的活性[24]。但是cGMP-PKG在糖尿病心肌损伤中的作用仍未见报道,在本次研究中,糖尿病心肌损伤的心肌组织cGMP的活性及PKG的蛋白表达显著降低,而有氧运动处理后心肌组织cGMP的活性及PKG的蛋白表达明显增加。提示,糖尿病心肌损伤中cGMP-PKG信号通路受阻,而有氧运动处理可激活cGMP-PKG信号通路,有氧运动对糖尿病心肌损伤发挥保护作用的机制与cGMP-PKG信号通路的激活有关。大量的临床前证据支持cGMP-PKG通路作为生存信号的关键作用,并证明其在心肌缺血再灌损伤时,作为最有希望的治疗靶点[25,26],尤其是通过钠尿肽刺激cGMP-PKG信号通路的活化,已经转化为急性冠心病患者的临床应用[27]。以上表明,cGMP-PKG途径在调节心血管方面的重要性得到越来越多的证据支持,表明该途径可能是有前途的治疗靶标。

综上所述,糖尿病心肌损伤时,心肌氧化应激增加、内质网应激增强和cGMP-PKG信号通路受阻,8周的有氧运动训练(游泳运动训练)可降低心肌氧化应激和内质网应激的发生,激活cGMP-PKG信号通路,发挥心肌保护作用。本研究的创新点在于提供了有氧运动改善糖尿病心肌损伤的新思路,为糖尿病心肌损伤的生理病理机制提供新思路,为其防治提供新的策略。