刘蕾，周颖，袁柳媚，马雁鸿，蒋佳，陈成，潘江，章薇，娄必丹

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410007

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

脑梗死（cerebral infarction）是目前我国成年人的主要致死、致残病因，是造成人均寿命缩短的重要因素[1]。研究发现脑缺血后会导致一系列的级联反应，如细胞膜去极化[2]、细胞能量与代谢障碍[3]、大量兴奋性氨基酸（excitatory aminoacids，EAA）释放[4]，引起急性脑组织坏死与迟发的程序性细胞凋亡，最终形成梗死灶。谷氨酸（glutamic acid，GLU）是兴奋性氨基酸中的主要神经递质，N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）是谷氨酸离子型通道受体中最重要的一种。而NR2A、NR2B是NMDA受体的重要调节亚单位，在脑缺血病程中具有双向调节作用[5-6]，既可以介导神经细胞凋亡通路，也可以激活神经细胞保护通路。针灸治疗缺血性脑卒中一直以来就是中医的优势，研究显示，针灸能促进神经和血管再生[7]、抑制神经细胞凋亡[8]等。本研究以MCAO大鼠为受试对象，探讨电针对脑缺血后不同时期NR2A、NR2B表达的影响。

材料与方法

1 实验动物

SPF级健康SD雄性大鼠60只，体重在240～260g，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证编号：SYXK（湘）2015-0008。分笼饲养，室内温度（24±2）℃，相对湿度50%～60%。实验过程中对动物的处置，符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

2 主要试剂及仪器

2.1 主要试剂 RIPA细胞裂解液（C1053，北京普利莱基因技术有限公司）、BCA蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit，CW0014S，康 为 世 纪）、PVDF膜（IPVH00010，Millipore）、封闭专用脱脂奶粉（P1622，北京普利莱基因技术有限公司）。内参一、二抗：Mouse Monoclonal Anti-Actin（TA-09，中 杉 金 桥，1/2000）、辣根酶标记山羊抗鼠IgG（ZB-2305，中杉金桥，1/5000）。目的抗体：Rabbit Anti NR2A （DF7955，Affinity，1/2000）、Rabbit Anti NR2B （AF6426，Affinity，1/1000）。

2.2 主要仪器 单道可调移液器（0.5-10ul、20-200ul、100-1000ul，梅特勒 -托利多仪器（上海）有限公司）、冷冻高速离心机（TGL-16D，常州中捷实验仪器制造有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-2，郑州宏朗仪器设备有限公司）、紫外分光光度计（UV-1600PC，上海美谱达仪器有限公司）、蛋白垂直电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）、恒温摇床（TC-100B，上海领成生物科技有限公司）、超高灵敏度化学发光成像系统（Chemi DocTM XRS+，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）、SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪、华佗牌0.18mm×13mm毫针（苏州医疗用品厂有限公司）。

3 动物造模及分组

所有大鼠均自由进水及饮食，适应性饲养3～4d，术前禁食1d。参照Longa E Z等[9]运用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠固定于手术台上，钝性分离左侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露左侧颈总动脉（CCA），再进一步分离CCA、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA），在CCA分叉部前剪0.2mm小口，然后将栓线（4-0尼龙线）插入，轻推尼龙线尾端经CCA分叉部沿ICA入颅，至大脑中动脉口，以阻断大脑中动脉（MCA）及颅内反流来的血流。

造模成功标准：对造模后自然苏醒的大鼠进行Zea Longa进行评分，得分1～3分的大鼠纳入实验，其余剔除。Zea Longa评分分为5级，0～4分制：0分，无神经损伤；1分，提尾时对侧前肢内收屈曲；2分，爬行时向对侧旋转；3分，站立或爬行时，向对侧倾倒；4分，无自主活动伴意识障碍。

将造模成功的大鼠按照随机数字表，完全随机分成模型组与电针心包经组各30只，再将2组的大鼠二次随机分成 1d、3d、7d、14d、21d 的 5 个亚组，每亚组各6只。

4 干预处理方式

4.1 电针心包经穴组 选穴：根据《实验针灸学》[10]动物穴位图谱及拟人比照法确定穴位定位。选取大鼠瘫痪侧肢体心包经穴：天泉、曲泽、内关、大陵穴。操作：在造模成功后第2天开始行电针治疗，按不同亚组处理方案进行干预，每日1次，每次30min。大鼠捆绑后用0.18mm×13mm毫针刺入大鼠瘫痪侧肢体心包经穴位，针刺深度2～4mm。取天泉、曲泽穴1组，内关、大陵穴1组。连接华佗牌电针治疗仪，极性固定，近心端接正极，远心端接负极，电针刺激参数： 连续波，输出电压2～4V，输出电流3～6mA，频率20Hz，强度以局部组织轻颤为度。

4.2 模型组 只做捆绑处理，不进行电针刺激。每日1次，每次30min，按不同亚组方案进行相应处理。

5 大鼠神经功能缺损评分

每组每只大鼠在造模成功后进行一次行为学评分，在处死取材前再一次进行评分。行为学评分根据孙敬芳[11]《动物实验方法学》大鼠行为学评分标准，满分为11分，分数越高，动物行为障碍越严重，用于评价大鼠脑缺血后运动功能的损伤及恢复情况。

6 Western blot检测NR2A、NR2B的蛋白表达

进行神经功能缺损评分后，处死大鼠，取缺血病灶的脑组织。将脑组织放入研钵中充分研磨，加入500ul的细胞裂解液，裂解细胞提取蛋白，用紫外分光光度计测定蛋白浓度。蛋白上样，将配置好的胶板架子放入到电泳液里拔去齿梳，加入一定体积的蛋白样品和Marker。开始电泳，60V压缩蛋白，80V分离蛋白（120min）。当条带跑至胶板一半的时候配置1×转膜液，并预冷。切好大小合适含有内参或目的条带的胶。放好海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵，用1×转膜液将海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵浸没，用300mA恒流转膜2h。用1×TBST配置3%的脱脂牛奶封闭液，室温封闭1h。配置1抗稀释液（根据抗体说明书推荐浓度），将PVDF膜孵育一抗过夜。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后弃掉1×TBST，重复3次。配置2抗稀释液（根据抗体说明书推荐浓度，1：2000稀释），将PVDF膜孵育二抗2h。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后弃掉1×TBST，重复3次。配置发光液，用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。

7 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件处理数据，运用Graph-Pad Prism 8软件绘图。计量资料用（）表示。 符合方差齐性和正态分布用两样本均数比较的独立样本t检验分析组间差异，组间比较选用 LSD检验。不符合方差分析条件的数据，用mann-WhitneyU检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠行为学评分

大鼠行为学评分，同一时相点与处理前比较，模型组仅21d亚组处理后评分降低（P＜0.05），即模型组大鼠的行为障碍在21d时有所减轻；电针心包经组3d、7d、14d、21d 亚组处理后评分明显降低（P＜0.05，P＜0.01），即电针经大鼠的运动功能在第3天就开始逐步改善。见表1，图1。

2 各组大鼠的NR2A蛋白表达

大鼠的NR2A蛋白表达，同1时相点与模型组相比，电针心包经组各亚组差异均具有统计意义（P＜0.05，P＜0.01）。电针心包经组大鼠的NR2A蛋白表达在 1d、3d、7d低于模型组，在 14d、21d时高于模型组。见表2，图2。

3 各组大鼠的NR2B蛋白表达

大鼠的NR2B蛋白表达，同1时相点与模型组相比，电针心包经组各亚组差异均具有统计意义（P＜0.01）。电针心包经组大鼠的NR2B蛋白表达在1d、3d、7d低于模型组，在 14d、21d时高于模型组。见表 3，图 3。

表1 MCAO大鼠行为学评分 （）

表1 MCAO大鼠行为学评分 （）

注：同一时相点，与处理前比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

时间 例数 模型组心包经穴组处理前 处理后 处理前 处理后1d 12 7.000±0.365 7.833±0.307 7.333±0.333 7.500±0.224 3d 12 7.000±0.258 7.500±0.224 7.333±0.558 5.667±0.211△7d 12 7.167±0.307 7.833±0.478 7.167±0.477 5.000±0.258△△14d 12 7.167±0.167 7.000±0.258 7.000±0.578 4.333±0.333△△21d 12 7.333±0.615 5.833±0.167△ 7.167±0.654 3.833±0.307△△

图1 MCAO大鼠同1时相点行为学评分比较

表2 MCAO大鼠的NR2A蛋白表达

图2 MCAO大鼠NR2A蛋白表达比较

讨 论

NMDA是谷氨酸离子通道型受体中重要的一种，而NR2A、NR2B是NMDA受体的主要调节亚基，调节NMDA受体离子通道动力学特性、激动剂亲和性以及对通道阻滞剂的敏感性，故不同NMDA受体亚型及不同的刺激方式，使NMDA受体具有不同的生物物理和生物化学特性。在脑缺血病程中，激活的NMDA受体，一方面可介导钙离子内流，造成Ca2+超载，引发一系列损伤级联反应；另一方面NMDA受体可以激活促进生存的信号通路，保护神经细胞免受缺血缺氧造成的损伤。大量研究表明，NMDA受体在脑缺血病程中具有的双向作用，与NR2A、NR2B的调节作用密切相关。

表3 MCAO大鼠的NR2B蛋白表达

图3 MCAO大鼠NR2B蛋白表达比较

在对NR2A、NR2B的研究中，有的学者认为NR2A主要参与缺血再灌注大鼠神经干细胞的增殖过程[12]，而在脑梗死状态下，NR2B表达量的增加与神经元损伤有着密切联系[13]。但也有学者发现，在脑缺血中NR2A表达上升时，脑梗死面积增加[14]，而通过一些药物降低NR2A的表达，有助于减少脑梗死中的神经损伤[15]，而NR2B在神经细胞的凋亡模型中发挥着明显的保护作用[16]。且缺血性脑梗死的发生和发展是一个动态、复杂而有序的过程，而NR2A、NR2B在病程的不同时期发挥的功能还未确定，其有可能在各时间段发挥着不同的作用。

研究表明，在脑缺血的早期，大量的GLU释放到细胞外，脑脊液中谷氨酸（Glu）在发病24 h内即可明显升高，而这种升高状态可持续1周[17]。因此，细胞外大量的GLU通过激活NMDA受体，介导Ca2+内流，造成Ca2+超载，引发一系列损伤级联反应。而Glu引起的Ca2+内流分为两个阶段，第一个阶段为快速的初始内流，第二阶段为延迟的更大内流。前者主要是由NR2A型受体介导，后者主要是激活含有NR2B的NMDA受体[18-19]。被激活的NR2A型受体依赖Ca2+超载，激活促凋亡信号通路。而NR2B型受体可以激活多种下游信号通路促进神经细胞凋亡，例如DAPK1[20]、CDK5[21]等。

并且在这个时期，NR2A、NR2B处于高表达状态，而通过降低NR2A、NR2B表达，可以有效提高缺血耐受性，降低神经功能缺损评分、缩小脑梗死容积，保护受损的神经元[22-23]。本实验数据显示，电针心包经组NR2A、NR2B蛋白表达，在第1天、第3天、第7天均低于模型组（P＜0.05）。且电针心包经组MCAO大鼠的行为障碍，在第3天开始得到改善。表明在脑缺血后1～7d，电针通过降低NR2A、NR2B蛋白表达，有利于保护神经细胞，提高缺血耐受性，改善大鼠运动功能。

在脑缺血的后期，细胞外的GLU浓度逐渐下降，大脑进入自身修复状态。此时，内源性神经干细胞被激活发育成熟并替补受损神经元，促进神经功能恢复，检测发现内源性神经干细胞在9～13d为增殖高峰，28d后分化为成熟神经元[24]，而NR2A、NR2B在神经元树突分支的发育与成熟中发挥着重要作用，参与了突触可塑性、记忆认知功能的形成，从而介导着神经细胞的生长发育过程[25-26]。有研究显示，在这个时期，NR2A、NR2B处于一个低表达水平，通过促进NR2A、NR2B的表达，有利于恢复受损的神经功能网络[27-28]。本实验数据显示，脑缺血后的第14天、第21天，模型组的NR2A、NR2B蛋白表达处于较低水平，电针心包经组NR2A、NR2B的表达水平显著升高，且在14d时已经超过模型组，第21天时电针心包经组NR2A、NR2B的平均蛋白含量分别是模型组的3.5倍、5.5倍。且电针心包经组行为学评分随治疗时间逐渐降低，提示大鼠的行为障碍减轻，运动功能逐步恢复。

综上，电针心包经在脑缺血的早期，可抑制NR2A、NR2B的表达，增加缺血耐受性，保护受损的神经细胞；而在脑缺血后期，通过促进NR2A、NR2B的表达，激活神经细胞存活通路，修复受损的神经细胞。