杨佳琪段小凤徐小茜田建霞郭建军

(1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2. 贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

九香虫作为传统药用昆虫已多次出现在临床药用上，近年来其对肿瘤细胞特有的功效引发学者们研究热潮，诸多学者对九香虫引起肿瘤细胞凋亡进行研究，结果证明，九香虫可引起肿瘤细胞凋亡，但其作用机制仍需进行试验研究[1,2]。故本试验采用特异性强以及灵敏性较好的荧光定量PCR方法从mRNA上检测九香虫血淋巴液作用于肿瘤细胞以后凋亡相关的基因表达，以此探究九香虫血淋巴液引起肿瘤凋亡的机制。

1 试验材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器与试剂见表1。

表1 主要仪器与试剂

1.2 试验方法

1.2.1 供试细胞的处理

分别培养人胃癌SGC-7901细胞与人乳腺癌MCF-7细胞至指数生长期，采取倍比稀释方法，使得2种细胞浓度至107个·mL-1。具体处理浓度及加样体积见表2，放置二氧化碳培养箱中培养24h，利用0.25%的胰酶进行消化后，使用PBS缓冲液洗涤肿瘤细胞2遍。

表2 九香虫血淋巴处理

1.2.2 制备RNA及测定其浓度

利用TRIzol方法制取肿瘤细胞RNA，并对RNA完整性进行测定，条件控制设定为110V，20min。

1.2.3 引物设计及合成

选用life technology公司设计与合成的引物，见表3。

表3 引物

1.2.4 去基因组DNA和cDNA的合成

按照表2中顺序于冰上进行基因组DNA的反应液配置操作，将PCR仪条件设为42℃,2min，而后终止反应，于4℃的冰上骤冷,反应条件见表4。

表4 去基因组DNA反应(10μL体系)

按照表5中顺序于冰上进行反转录的反应液配置，PCR仪条件控制为37℃、15min，而后85℃、5s进行反转录聚合酶的灭活，最后使反应终止，放于4℃的冰水进行骤冷，反应条件见表6。……