阙冬梅，梁国雄，杨娟，唐渝璐

中山陈星海医院皮肤科，广东 中山 528415

浅部真菌病是皮肤病中的常见病、多发病，其中足癣最为常见，尤其是在温暖潮湿的南方地区,春夏季节发病率非常高，因此需要一种简单、快速、准确的检测方法。KOH湿片法真菌镜检是既往最常用且有效的方法，但步骤相对繁琐，制片时间偏长，背景杂乱，真菌结构不易分辨和判断，易出现假阴性或漏诊。近年来荧光染色法真菌镜检得到越来越多的应用，本研究比较荧光染色法和KOH湿片法在不同类型足癣中的检出率和阅片时间，以供临床参考。

1 对象与方法

1.1 病例选择

收集我院皮肤科门诊2018年8月至2020年7月拟诊为足癣病例300例，其中118例拟诊为水疱鳞屑型足癣，104例拟诊为角化过度型足癣，78例拟诊为浸渍糜烂型足癣。本研究通过医院伦理审查，实验前患者均签署知情同意书。

1.2 设备与试剂

奥林巴斯CX23显微镜(增加荧光模块，日本奥林巴斯公司)；皮肤真菌检测系统(2016年版)。10%KOH溶液(实验室自配)；真菌荧光染色液(Baso,珠海贝索生物技术有限公司)。

1.3 方法

每个病例取材标本分成2份，分别采用荧光染色法和KOH湿片法真菌镜检。步骤如下：①取材：75%酒精消毒患处后，用钝刀刮取鳞屑或者疱液或者浸渍的表皮。皮损选取原则：水疱鳞屑型足癣选取鳞屑和疱液，角化过度型足癣刮除表面鳞屑后选择底部的鳞屑，浸渍糜烂型足癣刮除白色浸渍表皮，再采集皮损的边缘。②检测：KOH湿片法：加1滴10%KOH，覆盖玻片，酒精灯微加热，轻压盖玻片，用滤纸吸去周围溢液，置于光学显微镜下观察；荧光染色法：加1滴荧光染色液，停留10 s后覆盖玻片，轻压后用滤纸吸去溢出染色液，置于荧光显微镜下观察。③分别统计不同类型足癣使用两种检测方法的阳性和阴性例数，以及各自阅片时间(只统计阳性病例)。

1.4 阳性判断标准

由两个检测员进行读片，两人均看到菌丝或者孢子时判断阳性。当出现同一份标本判读结果不一致时，由第三位检测员进行判定。判断阴性的标本需要阅读整个玻片。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析，两种方法阳性率比较采用配对设计卡方检验或Fisher确切概率法，阅片时间的比较采用配对设计t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光染色法与KOH湿片法直接镜检镜下结构特点

荧光染色法镜下菌丝及孢子发出亮蓝色的荧光,与周围的淡蓝色背景形成鲜明对比，菌丝及孢子结构清晰可见，与周围角质细胞容易区分。部分临床病例真菌形态清晰可见，似培养状态下的菌丝结构，可初步根据形态特征对致病菌种进行提示性诊断(图1A)。即使极少量菌丝的情况下也能明确区分，断裂的菌丝片段分隔清晰可见，容易与污染杂质区分(图1B)。荧光染色下植物纤维素也会被荧光标记，但大小形态不同，形态不规则，边缘锐利，无菌丝和横隔，与片段化的菌丝可明确区别(图1C)。

图1 荧光染色法真菌镜检(400×) 1A:菌丝及孢子结构清晰可见，部分情况下呈现培养状态下的菌丝形态;1B:断裂的菌丝片段，结构清晰，可见典型分隔;1C:被荧光标记的植物纤维素，形态不规则且没有分隔

KOH湿片法镜下背景杂乱，菌丝及孢子与脂滴、气泡、杂质等不易分辨(图2)。

图2 KOH湿片法真菌镜检(400×):菌丝及孢子结构不清晰，容易与周围杂质混淆Fig.2 Under microscopy with KOH wet-mount (400×), unclear hyphae and spore structure, non-differentiable from surrounding impurities.

2.2 不同类型足癣使用两种检测方法的阳性率比较

在水疱鳞屑型、角化过度型、浸渍糜烂型三种不同类型的足癣中,荧光染色法检测阳性率分别为91.53%(108/118)、75.96%(79/104)、98.72%(77/78);KOH湿片法阳性率分别为80.51%(95/108)、47.12%(49/104)、97.44%(76/78)。两种方法阳性率在水疱鳞屑型和角化过度型足癣中差异均有统计学意义(2值分别为5.33、20.45，P值均<0.05)，而在浸渍糜烂型足癣中无明显差异(2=7.93，P=0.062)，详见表1。

表1 荧光染色法和KOH湿片法真菌镜检阳性率比较Tab.1 Comparison of the positive rates of various specimens under direct microscopy between fluorescent staining and KOH

2.3 不同类型足癣使用两种检测方法的阅片时间比较

荧光染色法与KOH湿片法检测水疱鳞屑型足癣阅片时间分别为(65.23±10.60) s、(90.75±12.15) s，差异有统计学意义(t=13.51，P<0.05);检测角化过度型足癣阅片时间分别为(90.52±13.23) s、(150.35±15.16) s，差异有统计学意义(t=15.60，P<0.05);检测水疱鳞屑型足癣阅片时间分别为(38.13±8.62) s、(48.28±16.20) s，差异有统计学意义(t=18.35，P<0.05)。

3 讨论

足癣由于传染性强，通过共用鞋袜即可发生感染，人群发病率高。根据临床表现通常分为3种类型，即水疱鳞屑型、角化过度型及浸渍糜烂型[1]。症状通常轻微，除瘙痒以外可无任何不适，患者重视度不够，常不治疗或者是自行随意购买外用药治疗，以上情况可导致足癣类型发生改变或导致难以辨认足癣的出现。

KOH湿片法是临床上直接镜检使用最早、最广的方法，该法操作简单、快捷、不需要特殊仪器。但KOH湿片法对真菌无染色强化作用，背景杂乱，需要操作者根据经验判读，有时会出现假阴性或者假阳性的情况。荧光染色技术使用特殊的荧光染料，可以特异性结合真菌细胞壁的几丁质和葡聚糖，在荧光显微镜下荧光标记的真菌易于观察，形态清晰，提高了真菌镜检的敏感性。基于镜下形态特征，还可以进一步对致病真菌菌种进行提示性诊断，更具有临床价值[2]。免疫荧光法容易掌握，操作与KOH湿片法一致，且一步到位，无需加热和等待时间，耗时短，结果更直观。既往研究表明荧光染色法在特殊标本如菌量少、毛发、甲屑或者经治标本等检测中阳性率更高，在头癣和甲癣的诊断中更有优势[3-5]。

本研究比较荧光染色法和KOH湿片法检测收集到的不同类型足癣发现，水疱鳞屑型足癣和角化过度型足癣荧光染色法阳性率明显高于KOH湿片法，尤其是菌丝量少的角化过度型足癣，研究结果与既往类似报道一致[6]。但在浸渍糜烂型足癣中，两种方法的阳性率差异无统计学意义，考虑与浸渍糜烂型足癣真菌生长活跃，真菌量多，不容易漏诊和误诊有关。这与杜鹏等[7]研究的荧光染色法在疑难标本如外涂药膏标本、色素减退型花斑癣皮屑、用药后复查标本，尤其是甲标本中的检查中有明显优势的结论相一致。

在菌量少、菌丝容易出现片段化的角化过度型足癣中，两种方法阅片时间均较长，但荧光染色法明显短于KOH湿片法。既往研究[4-5]发现荧光染色法在其他类型的浅部真菌感染检测中也能明显缩短阅片时间。本研究显示阅片时间在三种类型足癣中荧光染色法均短于KOH湿片法，差异有统计学意义。

荧光染色法可将菌丝染色，从而与周围细胞和杂质区分且真菌结构显示清晰，但植物纤维素也可以被荧光标记，尤其与断裂的片段化菌丝容易混淆，需要特别注意。本研究清晰地展示了两者的区别。既往研究[8]也有类似结论。

综上所述，荧光染色法检测水疱鳞屑型足癣和角化过度型足癣真菌感染优于KOH湿片法，尤其是在菌量少，出现片段化菌丝的角化过度型足癣的标本中，且耗时短，值得临床推广应用。