杨利，李小健，李朝军

作者单位：唐山市丰润区第二人民医院骨科，河北 唐山064000

骨肉瘤是常见的原发性恶性骨肿瘤，常发生于青少年，每年发病率多达1～3 人/100 万人，恶性程度较高，早期即可发生肺转移。目前对于骨肉瘤的治疗主要为手术切除辅以化疗，但效果并不理想，30%～40%的病人在诊断后5年内死亡，因此亟需寻求新的治疗方法。澳洲茄胺是一种来源于茄属植物的甾体生物碱，在我国主要存在于中草药龙葵中，具有免疫调节、抑制基因合成、诱导细胞分化等作用，在一系列肿瘤中发现具有治疗效应，包括宫颈癌、肠癌、肺癌、甲状腺鳞癌等，如崔焕波、艾金霞使用澳洲茄胺处理人宫颈癌ME180 细胞24 h，发现细胞存活率降低，细胞周期阻滞于G1 期，呈现出典型的细胞凋亡结构。但是，目前澳洲茄胺对人骨肉瘤细胞增殖是否具有抑制作用并未得到实验验证，作用机制也尚不清楚。因此，本研究通过构建人骨肉瘤细胞移植瘤裸鼠模型，观察澳洲茄胺对移植瘤生长是否具有抑制效应以及对细胞凋亡、血管生成相关因子表达的影响，并且初步探讨其作用机制，本研究于2018年1月至2019年3月完成。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40 只健康雌性的Balb/c 裸鼠购于北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（京）2012-0001，年龄范围4～5 周，体质量范围16～18 g，按照SPF（Specific pathogen free）级别饲养。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 主要试剂与仪器

澳洲茄胺购自成都曼思特生物科技有限公司，人骨肉瘤MG63 细胞株购于中科院上海细胞库；胎牛血清、Dulbecco 改良的Eagle培养基（DMEM）购于Gibco公司；一步法原位末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购于北京中杉金桥；蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒和增强化学发光（ECL）显色液购于上海碧云天；抗B 细胞淋巴瘤/白血病-2 相关X 蛋白（Bax）抗体、抗B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗体、抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）抗体、抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Cleaved caspase-9）抗体购于Abcam 公司；抗磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）抗体、抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体、抗磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体、抗蛋白激酶B（AKT）抗体购于Cell Signaling Technology 公司；抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体、抗凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）抗体购于Santa Cruz 公司；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购于Proteintech 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购于武汉博士德；凝胶成像仪Gel Doc XR购于Bio-Rad公司。

1.3 动物模型的构建与分组

MG63细胞培养于含有10%胎牛血清、1×10U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM 培养液中，放置于细胞培养箱中（37 ℃，5%二氧化碳）。将总体积为0.2 mL 的2×10个细胞悬液注射于裸鼠右侧腋窝皮下，3 d后出现皮下结节。参照文献中澳洲茄胺的使用剂量，将40只裸鼠随机分为4组，即对照组、低剂量组（10 mg/kg）、中剂量组（20 mg/kg）、高剂量组（40 mg/kg），每组10只。低剂量组、中剂量组、高剂量组裸鼠分别按照10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg 的剂量腹腔注射给药，分组后第1 天开始给药，隔日给药一次，连续4 周，对照组腹腔注射相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。

1.4 移植瘤质量和体积的测量

观察各组裸鼠的饮食、行为、精神状态等一般表现。分组后每7天测量一次移植瘤的长度和宽度，计算移植瘤的体积=（长度×宽度）/2。在末次给药的次日，即分组后第28 天，对移植瘤的长度和宽度进行测量后，颈椎脱臼法处死裸鼠，将移植瘤完整剥离后称重。

1.5 TUNEL 染色

取移植瘤组织放置于4%的多聚甲醛中固定48 h，30%的蔗糖溶液脱水24 h，包埋后使用冰冻切片机制作厚度约为10 μm的切片。按照一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行染色：PBS 洗涤2 次，在样品中加入50 μL 带有FITC标签的TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3 次，DAPI 复染后封片，使用倒置荧光显微镜观察和拍照。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting，WB）

将移植瘤置于液氮中，用研磨钵充分捣碎，每100 mg 的组织加入100 μL 蛋白裂解液，加入1%的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，冰上裂解2 h，期间每30 分钟斡旋1 min。待组织裂解充分，12 000 g 离心10 min，取上清液获得总蛋白，进行BCA 蛋白定量。取40 μg 的总蛋白与上样缓冲液混匀，100 ℃高温变性5 min，按照每孔20 μL 上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的脱脂牛奶室温封闭2 h 后，孵育抗Bax 抗体（1∶1 000）、抗Bcl-2 抗体（1∶1 000）、抗Cleaved caspase-3 抗体（1∶1 000）、抗Cleaved caspase-9 抗 体（1∶1 000）、抗VEGF 抗体（1∶1 000）、抗TSP-1 抗体（1∶500）、抗p-PI3K 抗体（1∶500）、抗PI3K 抗体（1∶1 000）、抗p-AKT 抗体（1∶500）、抗AKT 抗体（1∶1 000）和抗GAPDH抗体（1∶3 000）4 ℃过夜。次日取出膜，漂洗后室温孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗2 h。漂洗后，滴加ECL 显色液，使用凝胶成像仪曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0 软件测量各条带的灰度值，将对照组中目的蛋白条带和内参蛋白GAPDH条带的灰度值之比作为1。

2 结果

2.1 澳洲茄胺抑制肿瘤的生长

四组裸鼠的饮食、行为、精神状态等一般情况无明显异常和差异。10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组的移植瘤质量低于对照组，且40 mg/kg 组的移植瘤质量低于10 mg/kg组、20 mg/kg 组，差异有统计学意义（

P

＜0.05）。10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组的移植瘤体积在21 d 和28 d 时低于对照组，且40 mg/kg 组的移植瘤体积在21 d 和28 d 时低于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，差异有统计学意义（

P

＜0.05），见表1。

表1 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤质量和体积的比较/±s

2.2 TUNEL 染

色

10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组的TUNEL-FITC 的荧光强度高于对照组，且40 mg/kg 组的TUNEL-FITC 的荧光强度高于10 mg/kg组、20 mg/kg组。

2.3 澳洲茄胺对凋亡相关蛋白表达的影响

10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组 移 植 瘤 中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9 蛋白的表达量高于对照组，Bcl-2 蛋白的表达量低于对照组，且40 mg/kg 组 移 植 瘤 中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9 蛋白的表达量高于10 mg/kg 组、20 mg/kg组，Bcl-2 蛋白的表达量低于10 mg/kg 组、20 mg/kg组，差异有统计学意义（

P

＜0.05），见图1A和表2。

表2 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤组织中凋亡相关蛋白表达量的比较/±s

2.4 澳洲茄胺对VEGF 和TSP

-

1 表达的影响

10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组移植瘤中VEGF 蛋白的表达量低于对照组，TSP-1 蛋白的表达量高于对照组，且40 mg/kg 组移植瘤中VEGF 蛋白的表达量低于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，TSP-1 蛋白的表达量高于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，差异有统计学意义（

P

＜0.05），见图1B和表3。

2.5 澳洲茄胺对PI3K/AKT 信号通路的影响

10 mg/kg 组、20 mg/kg 组、40 mg/kg 组移植瘤中p-PI3K和p-AKT 蛋白的表达量低于对照组，且40 mg/kg 组移植瘤中p-PI3K和p-AKT蛋白的表达量低于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，差异有统计学意义（

P

＜0.05），但是四组移植瘤中PI3K 和AKT 蛋白的表达量差异无统计学意义，见图1C和表4。

3 结论

澳洲茄胺具有显著的抗肿瘤活性，是一种十分具有应用前景的天然药物，如李富仁、刘良发现，澳洲茄胺对于宫颈癌海拉细胞的生长具有显著的抑制作用。

本研究将处于对数生长期的MG63 细胞注射于裸鼠皮下构建动物模型，然后腹腔注射澳洲茄胺盐溶液，观察澳洲茄胺对移植瘤生长的影响。结果发现，澳洲茄胺处理组小鼠的移植瘤质量低于对照组，肿瘤体积增加程度也小于对照组，而且40 mg/kg组的移植瘤体积在21 d 和28 d 时低于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，移植瘤质量也低于10 mg/kg 组、20 mg/kg 组，表明给予澳洲茄胺的小鼠其移植瘤的生长受到显著抑制，而且具有剂量依赖效应。同时，给予澳洲茄胺干预的小鼠，在饮食、行为和精神状态等方面的表现同对照组无显著差异，体现出澳洲茄胺良好的生物安全性。

表3 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤组织中VEGF和TSP-1表达量的比较/±s

表4 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤组织中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的比较/±s

图1 WB检测40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠细胞凋亡与相关蛋白的表达情况：A为对凋亡相关蛋白表达的影响，B为对VEGF和TSP-1表达的影响，C为对PI3K/AKT信号通路的影响

肿瘤的发生发展，往往是由于多种不同的生理功能紊乱导致，其中抗凋亡作为其十分重要的生理特性之一，使得肿瘤细胞不断增殖且不受凋亡信号控制。我们推测，澳洲茄胺抑制MG63 细胞成瘤的具体机制可能通过促进肿瘤细胞凋亡，因此我们将小鼠移植瘤取下后制成冰冻切片观察，发现在给予澳洲茄胺的小鼠移植瘤中，凋亡的肿瘤细胞高于对照组，而且随着给药浓度的升高，凋亡的细胞越多。该结果表明，澳洲茄胺能够促进MG63 细胞凋亡，从而抑制其在裸鼠体内呈瘤，具有剂量依赖效应。

细胞凋亡受到多种蛋白的调控，其中Caspase家族在介导细胞凋亡中扮演着重要作用。当细胞发生凋亡时，上游多种凋亡活性物质释放，从而激活Caspase-9，进而活化Caspase-3 产生级联效应，引起细胞凋亡。另一方面，Bcl-2家族众中的Bax和Bcl-2 蛋白对细胞凋亡也具有重要的调控作用。其中，Bcl-2可以抑制Caspase 家族相关蛋白的活性从而抑制凋亡，而Bax能够激活Caspase相关蛋白，从而促进细胞凋亡。通过对移植瘤中凋亡相关蛋白进行检测，发现Caspase-9、Caspase-3以及Bax的表达在给予澳洲茄胺的移植瘤中均显著增加，但Bcl-2的表达降低，而且以40mg/kg组的效应最为显著。该结果表明在给予澳洲茄胺的小鼠中，促进凋亡的相关蛋白发生激活，然而抑制凋亡的蛋白受到抑制，使得MG63细胞的凋亡增加，导致移植瘤的生长受到抑制。

VEGF 参与调节皮肤、肺、脑、心脏、脊髓等一系列组织的修复和再生。VEGF 与骨肉瘤的发生、发展和转移也有密切的关系，如张黎明发现VEGF在骨肉瘤组织中呈高表达，可用于骨肉瘤临床病理的辅助诊断和预后评价。本研究对移植瘤组织的VEGF 表达进行检测，发现与对照组相比，澳洲茄胺处理组裸鼠的移植瘤中VEGF 的表达量显著降低，而且剂量越高VEGF 的表达量越低，表明澳洲茄胺可以抑制VEGF 的表达，具有剂量依赖效应。TSP-1 是一种强有力的内源性抗血管生成因子，具有抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡、抑制血管生成因子与受体结合等生物学效应，通过抑制血管生成对多种肿瘤的生长具有抑制效应。本研究结果显示，与对照组相比，澳洲茄胺处理组裸鼠的移植瘤中TSP-1 的表达量显著升高，而且剂量越高TSP-1 的表达量越高，表明澳洲茄胺可以上调TSP-1的表达，具有剂量依赖效应。

作为目前肿瘤相关研究的重要通路之一，PI3K/AKT 通路在多种肿瘤发展机制中均扮演重要角色，其中便包括抗肿瘤凋亡。PI3K 是一种磷脂酰肌醇激酶，具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，其下游的AKT 是原癌基因c-akt 编码的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，活化的AKT 能够影响下游多种效应分子，从而发挥多种重要的作用。大量研究表明，当PI3K/AKT 的过度活化后，能够通过各种转录因子，调节下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3 等多种凋亡相关蛋白，发挥抗凋亡作用。我们对移植瘤中PI3K/AKT 的相关蛋白进行检测发现，在给予澳洲茄胺后，该通路的PI3K和AKT蛋白表达差异无统计学意义，但是其磷酸化激活程度发生显著减弱，表明澳洲茄胺能够影响PI3K和AKT蛋白的活性，但具体影响其活性的方式还有待继续研究。

本研究的不足和展望：给予澳洲茄胺的浓度梯度不够，不能明确反应药物的浓度-药效关系；本研究仅检测了PI3K/AKT信号通路的表达变化，并认为其可能与澳洲茄胺诱导细胞凋亡、下调VEGF 表达、上调TSP-1表达等治疗效应有关，但是未进行基因敲减或过表达的实验，相关结论仍然缺乏足够的证据支持；目前，已有龙葵或其合剂应用于肝癌、骨髓瘤等肿瘤病人的报道，但是尚无龙葵在骨肉瘤病人中应用的报道，而且其活性成分澳洲茄胺也无临床应用的报道，本研究对于明确龙葵的抗肿瘤活性成分以及下一步澳洲茄胺的临床应用提供了理论基础。

综上所述，澳洲茄胺可以抑制MG63 细胞皮下移植瘤的生长，诱导细胞凋亡，下调VEGF 的表达，上调TSP-1 的表达，其作用机制可能与PI3K/AKT 信号通路的抑制有关。