邱 静，戴晓丽，王 琪，王婷婷，梁晓东

(1.江苏省盐城市第三人民医院病理科 224000；2.江苏医药职业学院，江苏盐城 224000)

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，5年生存率仅有14%[1]。近年来，肺腺癌所占比率有明显增长趋势，目前已成为多数国家最常见的肺癌组织学亚型。肺腺癌又分为众多亚型，其中，伴微乳头状结构肺腺癌(pulmonary adenocarcinoma with a micropapillary pattern,MPPAC)由AMIN等[2]在2002年首次报道，2011版肺腺癌组织学分类新标准首次将含有微乳头结构(micropapillary pattern,MPP)≥5%递增量的浸润性肺腺癌单独划分为一个新的组织学亚型，常与肺癌的其他亚型(如贴壁生长型、腺泡型、乳头型、实体型等)混合存在，纯型罕见。与普通型肺腺癌比较，MPPAC整体预后较差，易发生淋巴结转移及远处转移[3]。目前，有关MPPAC潜在分子机制尚不完全清楚。而肝细胞生长因子受体c(c-Met)为酪氨酸蛋白激酶家族成员，许多恶性肿瘤都伴有c-Met基因的扩增和过度表达[4]，c-Met信号通路有可能成为MPPAC的潜在治疗靶点。此外，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为重要的促血管生成因子[5]，其表达与MPPAC的关系也受到关注。目前国内对于c-Met、VEGF与MPPAC关系的研究尚少，本研究对116例肺腺癌根治标本分组进行免疫组织化学染色，比较c-Met、VEGF在MPPAC组及MPP阴性组中的表达，探讨两者表达的相关性，以及其与MPPAC患者临床病理因素的关系，分析其在肿瘤的发生发展及侵袭转移中的作用，为探寻有效的靶向药物治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年5月至2019年5月在江苏省盐城市第三人民医院行肺癌手术切除标本116例(排除术前行放/化疗及合并其他肿瘤患者)及50例癌旁正常肺组织，所有标本均经病理证实为腺癌，根据2011年发表的肺腺癌新分类诊断标准：以MPP是否大于5%将116例肺腺癌病例分为56例MPPAC组和60例MPP阴性组，50例癌旁正常肺组织为对照组。入选标本的组织学类型、分化程度及分期等均经高年资病理医师确诊。MMPAC组中男32例，女24例；年龄51～79岁，中位年龄66岁；占主要成分的肿瘤组织学分型，贴壁型2例、腺泡/乳头型31例、实体型9例，微乳头型14例；根据IASLC第八版国际肺癌TNM分期，Ⅰ期23例、Ⅱ期19例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例；无淋巴结转移者27例，有淋巴结转移者29例。MPP阴性组中男23例，女37例；年龄28～82岁，中位年龄63岁；占主要成分的肿瘤组织学分型，贴壁型13例、腺泡/乳头型36例、实体型11例；根据IASLC第八版国际肺癌TNM分期，Ⅰ期29例、Ⅱ期21例、Ⅲ期7例、Ⅳ期3例；无淋巴结转移者31例，有淋巴结转移者29例。

1.2 方法

采用免疫组织化学SP法检测c-Met及VEGF在各组的表达。兔抗人c-Met多克隆抗体、兔抗人VEGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP系列免疫组织化学检测试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡标本4 μm切片，脱蜡至水、3% H2O2封闭、高温高压法修复抗原、自然冷却，滴加封闭用正常山羊血清，30 min后去山羊血清，滴加稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，次日复温，滴加二抗，DAB显，苏木素染核，脱水，封片。结果判定:相应部位出现棕黄色或棕褐色颗粒，c-Met主要表达于细胞膜和细胞质；VEGF主要表达于细胞质。评分标准：采用半定量积分法[6]。按着色强度：未着色记0分，浅黄色为弱阳性记1分；棕黄色为阳性记2分；棕褐色为强阳性记3分；每张切片选取10个高倍视野(×400)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞所占比例小于或等于5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%为3分；上述两种评分相加，≥3分为阳性，<3分为阴性。结果由2名高年资病理医师进行盲法判读。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0软件对数据进行分析。采用χ2比较c-Met、VEGF表达各组组织中的差异。采用Spearman等级相关分析检验c-Met与VEGF的表达在56例MPPAC患者中的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MPPAC组、MPP阴性组和对照组肺组织中c-Met、VEGF的表达

c-Met阳性表达定位于细胞膜和胞质内，为棕黄色或棕褐色颗粒，其在各组中的表达情况见图1，MPPAC组中c-Met阳性表达率为69.64%(39/56)，明显高于MPP阴性组51.67%(31/60)和对照组6.00%(3/50)，差异有统计学意义(均P<0.05)；VEGF表达定位于细胞质内，为棕黄色或棕褐色颗粒，其在各组中的表达情况见图2，MPPAC组中c-Met阳性表达率为66.07%(37/56)，明显高于MPP阴性组50.00%(30/60)和对照组8.00%(4/50)，差异有统计学意义(均P<0.05)。

A:MPPAC组；B：MPP阴性组；C：对照组。

2.2 MPPAC组肺腺癌组织c-Met表达与VEGF的关系

本研究中，c-Met与VEGF在MPPAC组中共阳性表达36例，共阴性表达16例，经Spearman等级相关分析证明c-Met表达与VEGF表达呈正相关(r=0.783，P<0.01)，见表1。

表1 MPP阳性组中c-Met与VEGF蛋白表达的关系

2.3 MPPAC组肺腺癌组织中c-Met、VEGF表达与临床病理因素的关系

MPPAC组患者组织c-Met、VEGF的表达与肿瘤的分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、有无吸烟史、肿瘤大小及组织学分型无关(P>0.05)，见表2。c-Met、VEGF在MPPAC组各组织学分型中的表达见图3、4。

表2 MPPAC组c-Met、VEGF的表达与临床病理因素的关系

续表2 MPPAC组c-Met、VEGF的表达与临床病理因素的关系

A:贴壁型；B：腺泡/乳头型；C：实体型；D：微乳头型。

A:贴壁型；B：腺泡/乳头型；C：实体型；D：微乳头型。

3 讨 论

肺癌是目前全球第一大癌症，在我国肺癌的发病率和病死率居于恶性肿瘤的首位。近年来，肺腺癌发病率逐年提高。MPP作为恶性肿瘤的一种特殊的病理学形态，首先在乳腺癌中被描述，含有MPP的乳腺癌发现时临床分期较晚，预后较差[7]。MPPAC是一类浸润程度较强、易转移、预后差的恶性肿瘤。MPPAC可与任何一种肺腺癌组织学亚型混合存在，至今未发现单纯MPPAC报道。目前对于MPPAC的研究较少，其潜在的分子机制尚不完全明确，寻找以MPPAC为主的肺腺癌发生发展和预后相关的生物学标志物，检测癌基因与抑癌基因产物对肿瘤的影响，以寻求有效的靶向治疗成为近年来研究的热点。

c-Met基因为一种原癌基因，为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的唯一受体，其编码的蛋白属于酪氨酸激酶家族成员。活化后可激活多个下游信号通路，促进细胞的增殖、分化、抑制细胞凋亡，促进肿瘤血管生成等[8]。许多肿瘤中都伴有c-Met基因的扩增和过表达，如胃癌、结肠癌[9-10]等，c-Met阳性表达的癌细胞更具有侵袭性和远处转移的能力[11]，且有研究表明肺癌中Met基因扩增与分子靶向药物的耐药性相关[12]。

血管生成在肿瘤的生长、增殖及侵袭转移过程中至关重要。VEGF是目前发现的作用最强的促血管内皮细胞增殖与生成因子之一，可较好地诱导血管新生。它与肿瘤血管内皮细胞相应受体结合后，可刺激肿瘤血管内皮增生，诱导血管生成，增加血管通透性等，为肿瘤的生长、浸润和转移提供物质基础[5]。研究表明[13]具有MPP结构的肿瘤发生淋巴结转移可能与肿瘤组织中的VEGF表达明显升高有关。

本研究发现，c-Met、VEGF在MPPAC组肺腺癌中的表达明显高于MPP阴性组肺腺癌及对照组肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，且在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的肺腺癌组织中均呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)，提示c-Met及VEGF的过表达与MPPAC的发生发展及侵袭转移有关。且结果显示c-Met、VEGF表达与患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小及组织学分型无明显相关性。Spearman等级相关分析表明，c-Met表达与VEGF表达在MPPAC组肺腺癌组织中关系密切(r=0.783，P<0.01)。且c-Met表达与VEGF表达呈正相关，与文献报道一致[14]，表明在MPPAC中c-Met 与VEGF均对肿瘤的发生发展存在协同作用，两者共同参与促进肿瘤生长、增殖及调控肿瘤血管生成。研究表明[15]，c-Met活化后可促进VEGF的表达，而VEGF可促进血管内皮细胞分裂，刺激肿瘤的血管生成，故推测MPPAC易发生浸润、淋巴结转移及预后差可能与c-Met和VEGF在促进肿瘤血管生成方面的协同作用有关。因此，MPPAC患者中c-Met 与VEGF联合检测对判断病情、指导治疗、评价预后有一定价值。

综上所述，MPPAC中c-Met、VEGF均高表达，且在有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者组织中表达更高，说明c-Met、VEGF在MPPAC的发生发展中可能起重要作用，其高表达可能增加MPPAC患者侵袭、转移的风险，与患者生存率降低和预后差相关。c-Met表达与VEGF表达的相关性说明在MPPAC中c-Met 与VEGF均对肿瘤的发生发展起协同作用，c-Met可能通过促进VEGF的表达，从而促进肿瘤的增殖、迁移、侵袭及血管再生等。提示c-Met、VEGF的测定可以作为MPPAC发生发展的潜在生物标志物，对MPPAC的恶性程度及预后情况作出更加准确的判断，为临床诊断与治疗提供依据。c-Met、VEGF信号通路可成为MPPAC治疗中很有前途的靶点，抑制c-Met、VEGF的表达或许能够延长MPPAC患者复发时间，提升总体生存期。