刘志强，邹永周，何 敏，杨 平，屈新辉△

(1.江西省人民医院/南昌大学附属人民医院二部神经内科，南昌 330000;2.江西省景德镇市第一人民医院神经内科 333000)

抑郁症是全球致残性疾病之一。世界卫生组织(WHO)报告指出，2015年全球抑郁症数量约占总人数的4.4%，其中女性患病率为5.1%，男性为3.6%，全球总患病人数为3.22亿人[1]。抗抑郁性药物及心理治疗是目前临床治疗抑郁症的主要手段，但目前诊治的情况不容乐观，有研究显示其复发率高达80%[2]。有研究指出抑郁症与执行功能障碍、工作记忆及反应速度等认知功能下降有关，而海马是学习记忆的重要部位，但具体调节机制尚不明确。因此对抑郁症药物及其机制的研究成为焦点。

绿茶的主要成分绿茶多酚已被证实具有抗氧化作用，且有很高的安全性。有研究发现长期饮茶的人群抑郁症的患病率低[3]，但具体机制尚不明确。国外[4]及国内[5]发现绿茶多酚对强迫游泳小鼠及悬尾试验小鼠等抑郁模型具有抗抑郁作用，但对抗抑郁的具体机制研究不够深入。社会挫败模型是一种模拟社会和心理因素产生抑郁症的一种模型，被广泛应用。本实验以社会挫败模型研究绿茶多酚对其抑郁作用的影响及相关机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器设备、药品和试剂

3月龄CD1小鼠、2月龄C57BL/6小鼠购于北京维通利华公司，绿茶多酚(C0567)、磷酸化环腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，p-CREB)抗体(06-519)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗体、K252a购于美国Sigma公司。Western blot显影系统、强迫游泳行为学系统、水迷宫行为学系统。

1.2 方法

1.2.1社会挫败模型的建立

筛选攻击能力强的CD1小鼠，将C57BL/6小黑鼠放入CD1的笼子中，每天接触10 min，其他时间用带小孔的透明隔板将两小鼠分开。每天将C57BL/6小鼠暴露给不同的CD1小鼠，10 d之后进行社会交互实验的检测。进一步使用强迫游泳行为学系统、水迷宫行为学系统评估小鼠抑郁模型，对不符合要求的小鼠予以剔除。

1.2.2强迫游泳

将小鼠放在一个高20 cm、直径15 cm、水深10 cm、水温为(23±2)℃的盛水容器中，给小鼠制造一个无法逃离的环境，一段时间后，小鼠即表现出不动状态。先进行适应训练2 d，第3天记录后4 min中内总共静止的时间。

1.2.3水迷宫

将小鼠头面向池壁放在水中，记录小鼠找到平台所用时间(s)。在训练时，如果这个时间超过60 s，则引导小鼠到平台。让小鼠在平台上待10 s。每只动物每天训练4次，训练间隔15～20 min，连续训练5 d。上述训练结束后的第2天将平台撤除，进行探查训练，共60 s。探查训练后的第2天，进行对位训练，共4 d。将平台放回原平台所在的对侧象限，每天训练4次，统计达到平台所用的时间。

1.2.4对抑郁模型鼠腹腔注射不同浓度的绿茶多酚

取模型鼠24只分为3组，每组8只，分别为低剂量绿茶多酚(5 mg/kg)处理组，高剂量绿茶多酚(20 mg/kg)处理组及生理盐水处理组；另选取为正常C57BL/6鼠给予生理盐水处理，为空白对照组。对上述小鼠连续1周给予上述药物或生理盐水处理，每天给药时间固定，饲养条件相同。1周后先进行适应训练，后进行强迫游泳、水迷宫等行为学检测。

1.2.5海马组织微量注射BDNF阻断剂K252a

取模型鼠24只分为3组，每组8只，分别为高剂量绿茶多酚(20 mg/kg)处理组、K252a+高剂量绿茶多酚(20 mg/kg)处理组及生理盐水处理组；C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，固定在立体定向架上。切开头皮，在左右海马头骨上打孔。坐标为：前囟门后1.7 mm，中线附近±1.8 mm，硬脑膜下深度2.0 mm。植入套管，缝合皮肤。术后腹腔注射青霉素3 d。在绿茶多酚处理前，双侧海马微量注射K252a，每侧体积0.5 μL，注射速率0.2 μL/min，海马微量注射K252a剂量为10 μg/μL，其余各组注射等量生理盐水溶液。随后高剂量绿茶多酚处理组、K252a+高剂量绿茶多酚处理组注射绿茶多酚20 mg/kg,生理盐水处理组注射等量生理盐水。手术后，小鼠能自主活动后被关在笼子里。

1.2.6Western blot技术测定CREB、p-CREB及BDNF表达

取空白对照组、模型组、低剂量绿茶多酚组、高剂量绿茶多酚组C57BL/6小鼠各8只，断头处死小鼠，迅速取脑剥离获取双侧海马组织，用离心管分装，加入适量的蛋白裂解液，用匀浆器充分研磨组织，放置于冰上裂解30 min，将组织放于高速离心机离心15 min(12 000 r/min，4 ℃)，吸取上清液，用BCA法定量蛋白浓度。将样本与上样缓冲液按体积3∶1加入4 ×上样缓冲液，混匀，在100 ℃水中煮沸5 min，分装后置于-20 ℃冰箱冻存备用。用BCA法进行蛋白定量，各泳道加入30 μg蛋白，先用恒流后用恒压进行蛋白的电泳分离，转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，转膜时间为1 h。用10%的脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗p-CREB抗体(1∶2 000)、CREB抗体(1∶2 000)、BDNF抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，用TBST冲洗3次，加入二抗(1∶3 000)室温孵育1 h，TBST冲洗3次后加入ECL液显色。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 绿茶多酚可以改善模型小鼠强迫游泳不动时间且与浓度相关

与空白组[(60.3±3.9)s]小鼠比较，模型组[(113.8±10.3)s]小鼠的强迫游泳不动时间明显延长(P<0.05,n=8)；与模型组小鼠比较，低剂量绿茶多酚处理组[(96.7±9.2)s]和高剂量绿茶多酚处理组[(82.8±8.3)s]小鼠强迫游泳不动时间都下降，且绿茶多酚高剂量处理组下降得更明显(P<0.05，n=8)，见图1A。与模型组[(118.6±12.2)s]小鼠比较，高剂量绿茶多酚处理组[(80.6±8.1)s]小鼠强迫游泳不动时间下降(P<0.05，n=8)，而K252a能够逆转高剂量绿茶多酚的作用，K252a+高剂量绿茶多酚处理组[(118.6±12.2)s]小鼠强迫游泳不动时间与模型组[(113.5±8.7)s]比较,差异无统计学意义(P>0.05，n=8)。见图1B。

A:各组小鼠强迫游泳不动时间;B:海马微量注射K252a后各组小鼠强迫游泳不动时间。a:P<0.05,与空白组比较；b:P<0.05,与模型组比较。

2.2 绿茶多酚可以减少模型小鼠水迷宫潜伏期时间，且与浓度相关。

社会模型组[(46.4±4.3)s]小鼠的水迷宫潜伏期时间明显长于空白组[(20.5±2.4)s]小鼠(P<0.05,n=8)；单因素方差分析发现，与模型组比较,低剂量[(38.2±3.6)s]和高剂量绿茶多酚处理组[(30.2±3.1)s]小鼠水迷宫潜伏期时间都下降，且高剂量绿茶多酚处理组潜伏期时间下降更明显(P<0.05，n=8)，见图2A。与模型组[(48.9±4.3)s]比较，高剂量绿茶多酚处理组[(33.6±3.4)s]小鼠水迷宫潜伏期时间下降(P<0.05，n=8)，而K252a能够逆转高剂量绿茶多酚的作用，水迷宫潜伏期时间与模型组比较，K252a+高剂量绿茶多酚处理组[(45.3±4.1)s]差异无统计学意义(P>0.05，n=8)，见图2B。

A:各组小鼠水迷宫潜伏期时间；B：海马微量注射K252a后各组小鼠水迷宫潜伏期时间。a:P<0.05,与空白组比较；b:P<0.05,与模型组比较。

2.3 小鼠海马区CREB-BNDF通路参与绿茶多酚抗抑郁作用的调节。

与空白组比较，模型组小鼠海马区蛋白p-CREB相对表达水平、BDNF相对表达水平都下降(P<0.05,n=8)。而与模型组比较，低剂量和高剂量绿茶多酚处理组海马区p-CREB相对表达水平、BDNF相对表达水平表达升高，且高剂量组逆转更明显(P<0.05,n=8)，见图3。

A、B：Western blot图；C、D：Western blot分析图。a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较；c：P<0.01，与模型组比较。

3 讨 论

抑郁症也称为单相抑郁，是全球致残性疾病之一。美国资料显示，抑郁症人群中的年自杀率为83.3/10万，中国的年自杀率已达22.2/10万[6]。抗抑郁性药物及心理治疗是目前临床治疗抑郁症的主要手段，但目前诊治的情况不容乐观，有研究估计大约1/3的患者经治疗4个月后症状缓解[7]。治疗抑郁症的进展一直很缓慢，部分原因是制药行业退出了新型精神药物的开发，因此探索新的抑郁症药物及其机制意义重大。

绿茶多酚已被证实具有抗氧化作用，它经口服吸收后分布广泛，能够透过血脑屏障到达脑组织起着重要的神经保护作用，且安全性很高。有研究发现长期饮茶的人群抑郁症的患病率低。74名健康受试者参与了1个双盲随机安慰剂对照研究，连续5周口服绿茶或安慰剂,之后进行测量。结果表明，与安慰剂比较，饮用绿茶的参与者抑郁得分有所下降[8]。目前认为抑郁症的病因主要是精神应激、遗传因素和反复的躯体疾病，而精神应激为主要病因[9]。人类的应激因素无处不在，这些应激源可导致挫败感、情绪低落和兴趣缺失等抑郁症状产生。社会挫败模型是一种模拟社会和心理因素产生抑郁症的一种模型，被广泛应用。其中社会挫败应激模型，可以更好地模拟人类对于应激的反应。通过将小鼠暴露在10 d的社会挫败应激中，用以诱导小鼠的抑郁表现，形成社会挫败模型。本研究发现社会挫败模型小鼠的强迫游泳不动时间明显长于正常小鼠，说明社会挫败应激可以成功建立抑郁模型；而腹腔注射绿茶多酚1周能够使小鼠强迫游泳不动时间下降，且高剂量绿茶多酚处理组小鼠下降得更明显。

有研究指出抑郁症与执行功能障碍、工作记忆及反应速度等认知功能下降有关。有研究表明约40%的抑郁症患者存在至少一种认知领域的损伤[10]。同时，1项meta研究结果指出抑郁症治愈后执行功能的损伤可以恢复，表明执行功能的损伤与抑郁同时发生，而不是抑郁症的特征[11]。研究发现抑郁症患者与健康对照组比较，海马体积下降是最可靠的神经影像结构发现之一，多项meta分析结果表明4%～10%患者出现双侧海马体积下降超过40年，抑郁病史或者严重的抑郁患者海马体积减少的可能性更大，而使用抗抑郁药物3年后左侧海马体积增加，这也间接支持抑郁与海马体积之间的关系[12]。本研究结果也发现社会挫败模型小鼠的水迷宫潜伏期时间延长，说明抑郁小鼠认知功能下降。而腹腔注射绿茶多酚1周能够使小鼠水迷宫潜伏期时间下降，且绿茶多酚高剂量组下降得更明显，说明绿茶多酚改善抑郁的作用可能与改善认知功能有关。

很多研究显示，转录因子CREB与抑郁症的发病机制及抗抑郁药的效用相关。雒明池等[13]研究表明慢性温和不可预知性应激刺激致抑郁行为改变的小鼠较对照组出现海马内CREB表达水平下降[14]。而长期使用抗抑郁药物可提高海马CREB活性及海马区齿状回神经细胞的增殖和分化功能。有研究使海马CREB过度表达，随后激活一些神经生长因子营养因子(如BDNF)能够促进海马区新生神经细胞增殖、成熟及分化。因此认为CREB活性增高可能是抗抑郁作用的机制之一[13]。本研究也发现，模型鼠海马区蛋白p-CREB、BDNF表达都下降(P<0.05)，而绿茶多酚处理组可以逆转海马区p-CREB、BDNF表达，且高剂量组逆转更明显，表明绿茶多酚通过海马区CREB-BDNF通路参与调节社会挫败模型小鼠的抑郁行为。进一步研究也发现，通过双侧海马区微量注射BDNF阻断剂K252a阻断BDNF效应，强迫游泳和水迷宫的行为学试验都证实绿茶多酚改善抑郁行为的效应被K252a逆转。

因此，本研究发现绿茶多酚可以通过海马区CREB-BDNF通路改善社会挫败模型小鼠的抑郁行为。为绿茶多酚的抗抑郁应用提供更多理论依据。