桂 林,卞红磊,于溯洋,程敏静,梁春慧

(河北医科大学第三医院：1.肛肠一科；2.药剂科，石家庄 050051)

Afadin是近期发现的一种黏附连接蛋白，在细胞内与连接素(Nectins)、上皮细胞钙黏蛋白 (E-cadherin)及纤维状肌动蛋白(F-actin)等构成黏附连接，参与调控细胞定向移动、增殖等多种功能[1-3]。与此同时，多种肿瘤中存在Afadin编码基因的异常融合，在某些类型的肿瘤，例如乳腺癌[4]、子宫内膜癌[5]及胰腺癌[6]中，还存在Afadin表达水平的改变，本研究将检测Afadin在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中的表达情况，结合临床资料分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究已经通过本院临床研究伦理学会委员会批准(批准号：H2016-008-1)。所有患者均在本院肛肠一科手术，术前都未接受新辅助治疗。第一组病例包含2017年1-12月20例CRC患者，分别留取肿瘤组织及相对应的非肿瘤组织，进行蛋白免疫印记(Western blot)和免疫组织化学染色检测；第二组病例包含2010年1月至2013年1月共118例CRC患者，每例患者均拥有较为完整的病例资料和随访信息，肿瘤组织切片进行免疫组织化学染色评分，并与临床病理资料和预后资料进行相关性分析。

1.2 方法

1.2.1主要试剂

兔抗人Afadin多克隆抗体购于美国Abcam公司，SP试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒及电化学发光(ECL)试剂盒购于上海碧云天生物技术公司。

1.2.2Western blot

提取总蛋白，采取BCA法进行蛋白定量，每组上样20 μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜，一抗孵育过夜，二抗孵育1.5 h，ECL显影，以GAPDH为内参计算Afadin的表达水平。

1.2.3免疫组织化学染色及结果判定

切片脱蜡入水，热修复法进行抗原修复，滴加一抗后4 ℃孵育12 h，此后依次滴加二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，DAB显色，复染后脱水透明封片。……