宋 静，吴红海，刘建芳

中药丹参为唇形科多年生草本植物丹参的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消肿、除烦清心等功效[1]。丹参及其相关制剂在临床上常用于治疗心绞痛、月经不调、心烦不眠、经闭痛经等[2]。丹参药材主要产于河北、山东、河南、江苏、四川、浙江等省，受各地气候和生长环境的影响，导致其在质量和主要成分含量上存在很大的差异[3]，故加强其质量管理具有重要意义。丹参有效成分包括水溶性成分(丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、异阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸及丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等酚酸类化合物)和脂溶性成分(二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA等菲醌类化合物)，水溶性成分作用是治疗脑血管疾病[4-5]，脂溶性成分隐丹参酮有抗血小板聚集活性作用[6]。目前对丹参质量监测，脂溶性成分以丹参酮ⅡA为代表，水溶性成分以丹酚酸B为代表[1]，这种通过测定单一成分或几个指标成分的检测方法对评价丹参药材质量存在局限性，不足以全面评价药材质量。微乳电动色谱(microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)是一种以微乳液滴为分离介质的电泳分离技术，因其分离度高、适用范围宽，广泛用于药品、食品及环境样品的检测[7-9]。本研究拟采用MEEKC分析技术对来源于3个不同产地9个不同批次的丹参药材进行指纹图谱分析，然后采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件对获得的指纹图谱进行相似度评价，为丹参药材的质量监测和真伪辨别提供科学依据，并为控制丹参药材内在质量的均一性和稳定性提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1仪器 Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪、DAD检测器(美国Beckman公司)；弹性石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂，60 cm×50 μm，ID，有效长度50 cm)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ-3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；EYELA OSB-2100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；pH-3C型pH计(上海雷磁仪器厂)。

1.2试剂与样品 注射级大豆磷脂(SP)购于上海太伟药业股份有限公司；胆酸钠(SC)、聚凝胺(PB)、葡聚糖硫酸盐(DS)、十二烷基苯均购于美国Sigma公司；对照品：丹参素钠、丹酚酸B均购于中国药品生物制品检定所；迷迭香酸购于中国食品药品检定研究院。正丁醇、正辛醇(分析纯)购于天津市永大化学试剂有限公司；磷酸二氢钠(分析纯)购于北京北化精细化学品有限责任公司；二甲基亚砜购于天津市标准科技有限公司；化合物苯甲酰胺、邻甲苯胺、2-萘酚由河北医科大学药学院提供；甲醇(色谱纯)购于天津市康科德科技有限公司；实验用水为娃哈哈饮用纯净水。9批丹参药材产地分别为河北、山西和山东(表1)，均经河北医科大学药学院生药教研室研究人员鉴定为唇形科植物丹参的干燥根及根茎。

表1 9批丹参药材样品产地及批号

1.3电泳条件

1.3.1检测条件：毛细管柱总长度60 cm(内径50 μm，有效长度50 cm)，用20 kV恒压分离，检测波长208 nm，压力进样：0.8 psi，8 s，柱温25℃。

1.3.2微乳流动相的制备：微乳处方构成为SP∶SC∶正丁醇∶辛醇∶20 mmol/L磷酸二氢钠磷酸盐缓冲液=2.0∶3.5∶6.0∶0.7∶87.8(pH=7.4)。称取处方量的生物表面活性剂SP和SC于密封性容器内，用水相(20.0 mmol/L磷酸二氢钠磷酸盐缓冲液)溶解，依次加入助表面活性剂正丁醇、油相辛醇，摇晃均匀、超声30 min，在室温条件下静置12 h以上至微乳溶液摇晃后仍可保持澄清，则表明稳定微乳体系形成，最后用饱和氢氧化钠调pH值至7.4备用，用前用0.45 μm滤膜过滤[10]。

1.3.3毛细管预处理：①毛细管活化：首先用甲醇冲洗新管3 min，再依次用水0.5 min、0.1 mol/L盐酸15 min、水0.5 min、1.0 mol/L氢氧化钠15 min冲洗，静置30 min。②毛细管涂层：先用5% PB水溶液冲洗20 min，静置20 min后，再用3% DS水溶液冲洗20 min，静置30 min，用水冲洗5 min即可使用[10]。

1.4溶液制备

1.4.1对照品溶液的制备：分别精密称取丹参素钠1.0 mg、迷迭香酸5.0 mg、丹酚酸B 5.1 mg置于容量瓶中，用甲醇溶解定容至5 ml，得到浓度分别为0.2 mg/ml的丹参素钠、1.0 mg/ml的迷迭香酸、1.02 mg/ml的丹酚酸B对照品储备液。

1.4.2供试品溶液的制备：称取丹参药材粉末(过60目筛)5.0 g于具塞锥形瓶中，加入75%的甲醇20 ml，超声提取60 min，过滤得滤液；残渣中再加入甲醇20 ml，超声提取60 min，过滤得滤液。合并滤液，减压浓缩，用甲醇定容于5 ml容量瓶中，得1.0 g/ml丹参提取液。取丹参提取液500 μl，加入到“1.3.2”项下制备的500 μl微乳流动相中，加入电渗流标记物二甲基亚砜6 μl、微乳标记物十二烷基苯4 μl摇匀作为供试品溶液。标准混合液制备：微乳流动相1 ml，加入苯甲酰胺甲醇溶液(30 mg/ml)6 μl、邻甲苯胺甲醇溶液(100 mg/ml)6 μl、2-萘酚甲醇溶液(100 mg/ml)4 μl和电渗流标记物二甲基亚砜6 μl、微乳标记物十二烷基苯4 μl[10]。

1.4.3保留因子的测定与计算：采用“1.3.1”项下检测条件测定，保留因子logk计算公式如下[11]：

tS、tEOF和tME分别代表待测物、二甲基亚砜和十二烷基苯的迁移时间。

1.5方法学考察

1.5.1溶质迁移时间和保留因子重现性：为减少迁移时间变化带来的溶质logk测定误差，以及保证测定的准确性，在每个样品溶液中都加入二甲基亚砜和十二烷基苯[12]。以组成SP∶SC∶正丁醇∶辛醇∶20 mmol/L磷酸二氢钠磷酸盐缓冲液=2.0∶3.5∶6.0∶0.7∶87.8的微乳(pH=7.4)为MEEKC分离介质，用标准混合液进样，考察动态涂层条件下溶质迁移时间的重复性，色谱图见图1。测定样品前，先用标准混合液检测涂层的稳定性，若化合物迁移时间的RSD在3.0%内，则表明涂层稳定。

图1 标准混合液的典型色谱图

1.5.2精密度试验：取S1号样品，按照“1.4.2”项下的方法制备供试品溶液，连续进样5次，测定指纹图谱，1号峰作为参照，计算各共有峰的相对迁移时间和相对峰面积，结果RSD均小于3.0%，表明供试品进样精密度良好，符合指纹图谱要求。

1.5.3稳定性试验：取S1号样品，按照“1.4.2”项下的方法制备供试品溶液，分别测定样品在0、2、4、6、12、24 h的指纹图谱，以1号峰为参照，计算各共有峰的相对迁移时间和相对峰面积，结果RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

1.5.4重复性试验：取S1号样品，按照“1.4.2”项下的方法制备供试品溶液6份，平行操作，测定指纹图谱，以1号峰为参照，计算各共有峰的相对迁移时间和相对峰面积，结果RSD均小于3.0%，表明本实验测定方法的重现性良好，符合指纹图谱的要求。

以上结果表明指纹图谱中各色谱峰的相对迁移时间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱研究的要求。

2 结果

2.1指纹图谱的建立 精密称定不同批次(S1～S9)的丹参粉末，分别按照“1.4.2”项下的方法制备并进行测定。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”分析，用S1号样品图谱作为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1，采用中位数法自动匹配生成丹参指纹图谱共有模式(即对照图谱，图2)，丹参叠加图谱见图3。

图2 丹参药材磷脂-微乳电动色谱指纹图谱

图3 9批丹参样品微乳电动色谱指纹图谱共有模式 S1～S9分别表示9种不同批次丹参样品

2.2指纹图谱分析

2.2.1共有指纹峰：分析比较9批丹参样品的MEEKC色谱图，以丹参7个共有峰作为指纹图谱的特征峰，通过相对保留因子(表2)及标准加入增高法，确认1号峰为迷迭香酸，4号峰为丹参素，5号峰为丹酚酸B。其中以1号峰迷迭香酸峰为参照峰，分别求出各共有峰与之相比的α值(保留因子logk之比)和各共有峰相对峰面积之比见表3。

表2 9批丹参样品微乳电动色谱指纹图谱中7个共有峰的相对保留因子α值

表3 9批丹参样品微乳电动色谱指纹图谱中7个共有峰的相对峰面积

2.2.2指纹图谱聚类分析：经过比较分析，丹参药材的磷脂-MEEKC指纹图谱中比较明显的共有峰有7个。根据表3中的相对峰面积比值，用统计学软件SPSS 21.0采用hierarchical cluster analysis对9个不同批号的丹参样品进行聚类分析，聚类方法为between groups linkage，以欧式距离作为样品测度，得聚类分析图，见图4。当距离标尺为1时，样品S1、S2、S7、S8，样品S3、S9，样品S4、S5与样品S6各归为一类；距离为2时样品S3、S9与样品S6归为一类；距离为3时，样品S1、S2、S7、S8与样品S3、S6、S9归为一类；距离为25时，所有样品才归为一类。

图4 丹参药材磷脂-微乳电动色谱指纹图谱的聚类分析图

2.2.3相似度评价：将测定的MEEKC数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”软件，经多点校正取Mark峰，匹配色谱峰，生成对照图谱，行各批次色谱峰差异性和整体性评价。相似度值：S1-0.995，S2-0.996，S3-0.995，S4-0.883，S5-0.999，S6-0.989，S7-0.995，S8-0.989，S9-0.994。除S4外，其余批次丹参样品指纹谱相似度良好。

3 讨论

3.1MEEKC MEEKC是在胶束电动毛细管色谱基础上发展起来的一种电泳技术，由于微乳介质的高溶解性，更加拓宽了毛细管电动色谱法的分离范围，可分离水溶性、脂溶性、带电或不带电物质。因MEEKC分离效率高、适用范围广和样品消耗量少，在药物分离中广泛应用。经典的微乳体系常以十二烷基硫酸钠为表面活性剂，使用未涂层石英毛细管在碱性条件下分离。本文将磷脂-MEEKC用于丹参药材指纹图谱的研究，与高效液相色谱法相比，具有溶剂耗费少、环保、成本低的特点。本研究首次将磷脂修饰的MEEKC技术引进到丹参药材指纹图谱研究中，以含生物类表面活性剂SP和SC制备的微乳作为分离介质，经离子动态涂层法在人体血液pH=7.4条件下分离成分，一是探索MEEKC用于指纹图谱研究的可行性，二是利用磷脂微乳的特殊结构，模拟药物在体内透膜过程[10]。

3.2保留因子及涂层方法考察 本研究采用PB、DS进行动态涂层，与未涂层的石英毛细管裸管相比，在检测样品时更稳定，重现性更好[12-13]。本研究在动态涂层条件下以同批次微乳为MEEKC分离相，测定标准混合液，考察溶质迁移时间重复性。结果连续测定3 d，3种化合物的迁移时间RSD在2.5%内。随着进样次数的增多和检测时间的延长，迁移时间RSD变大，原因可能是样品在毛细管内壁的吸附或离子涂层的损坏。为保证测定准确性，在测定样品时，用标准混合溶液进行重复性检测，如标准样品的迁移时间出现较大偏差，则对毛细管冲洗处理；冲洗后无改善则需重新涂层毛细管。

3.3检测波长的选择 本研究采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察并结合相关文献报道[14-15]，根据药物的紫外吸收特征，比较不同波长的色谱图，发现208 nm波长处丹参药材色谱图中色谱峰较多，且电渗流和微乳液滴标记物及对照品均有较好吸收，因此确定208 nm为检测波长。

3.4实验结果分析 本研究测定出丹参药材成分均为水溶性成分，而未定性出脂溶性成分。原因可能为丹参药材中脂溶性成分含量较低[16]，电动色谱法虽分离效率高，但灵敏度较低，本研究方法的检测限测不到脂溶性成分，与已报道的其他分离介质电动色谱检测结果一致[15]。相似度实验结果表明，除河北1个批次丹参药材外，其余各产地不同批次丹参样品指纹图谱相似度较好(>0.989)。但不同产地间同一成分峰面积不同，此研究结果表明，不同产地药材间同一成分含量存在差异。

本研究建立的丹参药材磷脂-MEEKC指纹图谱具有较好的精密度和重现性，能够应用本研究的指纹图谱技术对丹参药材的质量进行全面评价，检测出不同产地及不同批次药材间的质量差异。