王 弛，刘 慧 ， 吴文晞 ，褚克丹，赵 峰*

(1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 福建省恒正检测技术有限公司，福建 福州 350199)

药材金线莲为兰科金线莲属植物金线莲(Anoectochilus roxburghii)的干燥全草，由于人为釆挖以及自然生境破坏，野生金线莲濒临灭绝，人工繁育成为解决金线莲市场供应不足问题的一种重要途径[1]。金线莲在栽培生长过程中会受到各种环境因子的影响，光作为最重要的环境因子之一，对金线莲的分化发育、形态建成及代谢等方面有深刻影响。另外在给予植物一定的非生物胁迫后，一些游离氨基酸的含量会增加来减轻胁迫的不利影响[2—6]。因此研究光质对金线莲游离氨基酸的影响，对提高金线莲产量与品质具有指导意义，有助于缓解有限的金线莲产量与越来越大的需求之间的矛盾。Ye等[7]和冼康华等[8]通过研究不同光质对金线莲生长发育的影响，发现蓝光培养下的金线莲鲜重最高，茎最健壮，叶面积最大，并且光合色素浓度和抗氧化酶活性(CAT、SOD 和 POD)最高。吴水华等[9]通过使用柱前自动衍生HPLC-FLD法测定不同金线莲的游离氨基酸含量，共检测出15种游离氨基酸，发现组培金线莲移植至林下后，氨基酸含量明显下降，移植时间越长，降低越明显。许梦洁等[10]使用全自动氨基酸分析仪比较不同种质的金线莲游离氨基酸含量，共检测出16种氨基酸，天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量明显高于其他氨基酸组分。前人研究发现，蓝光可以促进金线莲黄酮类成分与多糖类成分含量增加，对于游离氨基酸组分含量变化缺乏系统研究。本研究通过AQC柱前衍生结合超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)，对蓝光胁迫下的金线莲游离氨基酸进行定量测定，并探究蓝光胁迫对金线莲游离氨基酸的影响，为栽培过程中寻找有效提高生物量的光照条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及实验处理

将泥炭土(丹麦，品氏)和珍珠岩(中国，德沃多)按照2:1(体积比)混合成栽培基质，称取40 g，装入塑料育苗盆(口径8 cm，盆高11 cm，底径4.8 cm)，并栽入金线莲苗(组培4个月)，浇足量水后，在LED人工气候箱进行1个月适应性栽培，期间每周浇施60 mL去离子水。

实验设置四组光照条件处理，对照组(CK)给予30 μmol·m–2·s–1白光，其余三组在对照组的基础上，提供三种强度蓝光，分别为 60 μmol·m–2·s–1(L 组)、120 μmol·m–2·s–1(M 组)和 180 μmol·m–2·s–1(H 组)，培养箱环境参数为光周期14 h、温度25 ℃、相对湿度75%，随后，按照一周浇去离子水1次(每盆60 mL)，下一周浇施营养液(浓度 1 g·L–1，每盆 60 mL)的频率，持续管理56 d。期间分别取(第0、7、14、21、28、42和56天)全草样品，去离子水洗净后，液氮速冻后，冻干，置于-80 ℃冰箱。

1.2 仪器与试剂

Nexera X2 LC-30A高效液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)，串联Sciex 4500 Q-Trap质谱仪(美国，Sciex公司)、XS 105分析天平(美国，梅特勒公司)、KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、Milli-Q Integral 5超纯水机(默克公司)、LGJ-10FD真空冷冻干燥机(北京松源华兴生物技术有限公司)、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、MM400球磨仪(德国Retsch公司)。

33种氨基酸标品：同型半胱氨酸(Hcy)、γ-氨基丁酸(γ-ABA)、α-氨基丁酸(α-ABA)、β-氨基丁酸(β-ABA)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、茶氨酸(Thea)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Giy)、胱氨酸(Cys2)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、瓜氨酸(Cit)、精氨酸(Arg)、肌氨酸(Sar)、1-甲基-L-组氨酸(1-M-His)、3-甲基-L-组氨酸(3-M-His)、赖氨酸(Lys)、羟赖氨酸(Hy-Lys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Lle)、鸟氨酸(Orn)、羟脯氨酸(Hy-Pro)、色氨酸(Trp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)均购自源叶生物科技有限公司(中国，上海)，色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、甲酸铵(中国，安谱实验科技股份有限公司)。

1.3 游离氨基酸组分测定方法

参考陈思肜等[11]的方法，按照AQC柱前衍生法测定33种游离氨基酸组分。称取样品0.050 g，加5 mL超纯水涡旋混合，超声30 min后，冷冻离心5 min(10 000 r·min–1，4 ℃)，上清液过 0.22 μm 微孔滤膜后取10 μL与硼酸盐缓冲溶液70 μL (pH 8.8)在内衬管中混合，加入AQC试剂20 μL，涡旋混合后55 ℃烘箱衍生10 min，冷却后使用超高效液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)测定。色谱条件为柱温40 ℃；流速0.3 mL·min–1；流动相A：甲酸铵溶液(10 mmol·L–1，pH 6.0)；流动相 B：乙腈。梯度洗脱程序：0～12 min，5% B～20% B；12～16 min，20% B～35% B；16～18 min，35% B～90% B；18～19 min，90% B～5% B；19～23 min，5% B。进样量1 uL。质谱条件为电喷雾电离(ESI)源；正离子模式为多反应检测模式；电喷雾电压4500 V，气帘气压力30 psi，辅助气温度550 ℃，喷雾气压力55 psi，辅助加热气压力55 psi。

1.4 数据分析

样品中氨基酸含量以干基计，水分含量测定方法参考GB 5009.3-2016。用Excel表对数据进行初步处理，采用SPSS 23.0对数据进行方差分析，所有处理在P<0.05水平下比较氨基酸之间的含量差异。图表采用PRISM 8.0绘制。对氨基酸定量结果标准化后使用TBtools软件绘制热图。

2 结果与分析

2.1 金线莲游离氨基酸总含量分析

由图1可知，随着光照时间的延长，处理组游离氨基酸总量呈先增加后减少的变化趋势。处理组在第7天时，L组含量显著降低，M组和H组含量与CK组无显著性差异；第14天时，各处理组含量均有不同程度的增加，H组含量显著高于CK组；第21天各处理组含量均显著下降，分别为第14天时含量的64.1%、76.6%、63.6%；第28天到56天，处理组游离氨基酸含量呈波动下降趋势，均显著低于CK组。

图1 不同强度蓝光对金线莲游离氨基酸含量的影响Fig. 1 The effect of different intensities of blue light on the amount of free amino acids in Anoectochilus roxburghii

2.2 游离氨基酸组分的变化

将不同处理时间的游离氨基酸组分含量汇总制成热图(图2)，可以看出绝大多数游离氨基酸组分在第14天含量最高，呈现先增加后减少的变化趋势。

图2 金线莲蓝光胁迫下游离氨基酸组分及含量变化热图Fig. 2 Heat map of free amino acid composition and content change in Anoectochilus roxburghii under blue light stress

在金线莲中共检测出22种游离氨基酸组分。其中天冬酰胺含量最高，未进行胁迫处理时的含量为62.44 mg·g–1；其次是天冬氨酸，含量为 33.87 mg·g–1；第 3是 γ-氨基丁酸，含量为 4.12 mg·g–1；第 4和第5位是谷氨酰胺和精氨酸，含量分别为 3.19 mg·g–1和2.90 mg·g–1。这5种游离氨基酸含量远高于其他游离氨基酸组分。根据游离氨基酸组分的变化情况分为三类：(A) 仅在蓝光胁迫第14天时含量最高，如脯氨酸、精氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；(B)在胁迫第7天和第14天含量上升的游离氨基酸，如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸和组氨酸；(C)在CK组和胁迫第7、14天含量一直维持高含量的游离氨基酸，如丝氨酸、肌氨酸、赖氨酸、γ-氨基丁酸和天冬氨酸(图2)。

2.3 金线莲中氨基酸含量间的相关性分析

由表1可知，天冬酰胺与谷氨酰胺的相关性系数最高，达 0.87，两者呈极显著正相关，天冬酰胺与其他游离氨基酸组分同样呈极显著正相关，相关性从大到小依次为γ-氨基丁酸、肌氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸和鸟氨酸；天冬氨酸与γ-氨基丁酸相关性系数最高，为 0.88；蛋氨酸与天冬酰胺、天冬氨酸、瓜氨酸、肌氨酸和赖氨酸呈极显著负相关。综上所述，高含量的氨基酸作为蓝光胁迫下金线莲游离氨基酸含量变化的主要指标呈现显著正相关。

表1 金线莲中游离氨基酸含量间的相关性Table 1 Correlationam ong the content of free aminoacids in Anoectochilus roxburghii

2.4 主成分分析

对不同胁迫时间下金线莲游离氨基酸组分进行主成分分析，计算主成分特征值、方差贡献率和累积方差贡献率，结果如表2、表3。金线莲中游离氨基酸前 5个主成分的累计方差贡献率达87.153%，累计贡献率大于85%则认为这5个因子对金线莲中游离氨基酸的评价起主导作用[12]。第1主成分特征值为11.052，方差贡献率为50.237%，代表金线莲中 22种游离氨基酸组分含量全部检测结果50.237%的信息，而由旋转后的主成分因子载荷矩阵可知，第1主成分中苏氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、肌氨酸、组氨酸、天冬酰胺和酪氨酸的系数占比大于 0.8，故将其作为金线莲特征氨基酸进一步分析。

表2 主成分分析特征值及方差贡献率Table 2 Principal component analysis eigenvalues and variance contribution rate

表3 主成分矩阵Table 3 Principal component matrix

以上8种特征游离氨基酸中，天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、苏氨酸和组氨酸均含量较高，其在CK中的百分含量依次为：55.2%、2.8%、0.3%、0.2%、0.1%，它们在胁迫第14天后含量达到最高(相较CK组增加幅度分别为11.2%、66.8%、90.1%、47.2%、49.0%)，但蓝光强度与氨基酸增幅间未见显著正相关；而缬氨酸和酪氨酸含量上升幅度与蓝光强度间确存在显著呈正相关(相关系数分别为0.45和0.44)，第14天高强度蓝光处理组较CK组的提高幅度分别高达97.5%和85.3%，但两种氨基酸在金线莲中绝对含量较低，分别为0.1%和0.07%；对肌氨酸而言，短期的蓝光胁迫可小幅促进其含量上升(24.0%～34.1%)。

2.5 聚类分析

对不同时间下金线莲的游离氨基酸含量进行聚类分析(Ward法，欧氏距离)，结果如图3。在距离10处将处理组分为3类，第42天和56天的金线莲聚为一类，游离氨基酸组分含量最低；第 21天和28天的金线莲聚为一类，含量为中等；CK组、第7天和第14天的金线莲聚为一类，游离氨基酸组分含量最高。

图3 不同时间蓝光胁迫金线莲游离氨基酸含量聚类分析Fig. 3 Cluster analysis of free amino acid content of Anoectochilus roxburghii at different times of blue light stress

3 讨论

氨基酸作为蛋白质的组成部分，在生物的物质合成、信号传递和应激反应中起重要作用[13]。本实验采用 AQC柱前衍生法测定不同强度蓝光胁迫下金线莲游离氨基酸组分，相比前人的研究[9—10,14]，在金线莲中额外检测到 γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、瓜氨酸、肌氨酸和鸟氨酸等6种氨基酸。Koppitz等[15]发现天冬酰胺因其高 N/C比值作为植物N代谢中主要的运输和储存化合物。金线莲在蓝光胁迫初期，天冬酰胺含量显著增加，这与 Leap等[16]的研究一致，但随着时间延长，含量逐渐下降，这可能是因为植物体内次生代谢产物的合成积累加强，天冬酰胺被大量消耗[17]。γ-氨基丁酸是一种应激指标[18]，在植物遭受非生物胁迫时快速积累，金线莲 γ-氨基丁酸含量在胁迫前期显著增加，这与Xing等[19]的研究一致。苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸以天冬氨酸为底物，通过Asp家族氨基酸途径合成[20]，精氨酸和酪氨酸分别通过天冬氨酸-精氨酸琥珀酸合酶和天冬氨酸-预苯酸转氨酶途径合成[21]。以上游离氨基酸组分均在金线莲蓝光胁迫第14天时含量增加，推测是由于作为底物的天冬氨酸浓度上升导致，证明蓝光胁迫对这些氨基酸的合成有促进作用。

4 结论

本实验在金线莲中检测到22种游离氨基酸，其中天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、肌氨酸、组氨酸和酪氨酸为金线莲特征氨基酸；短期蓝光胁迫能促进多种游离氨基酸合成，在光密度30 μmol·m–2·s–1白光基础上补充 180 μmol·m–2·s–1蓝光时胁迫14 d时效果最好，是一种具有较高开发价值的栽培手段。