孔 凡，郝 青，刘政安，舒庆艳*

(1. 中国科学院植物研究所中科院北方资源植物重点实验室，北京 100093；2. 中国科学院大学，北京100049；3. 青岛农业大学园林与林学院，山东 青岛 266109)

牡丹(Paeonia suffruticosa)是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)多年生落叶亚灌木，原产于中国，在我国有1600余年栽培史。牡丹也是重要的资源植物，兼具观赏、药用和食用价值。2011年凤丹(P. ostii)和紫斑牡丹(P. rockii)籽油获批新资源食品，2013年凤丹花瓣获批新资源食品原料。此外，牡丹花水、牡丹提取物等已被批准列入化妆品原料目录(2021版)，扩大了其应用范围。目前以牡丹花为材料的相关研究主要集中于色素组成、含量、呈色机理及花瓣提取物的抗氧化活性等，分离鉴定的化合物主要有黄酮、黄酮醇及花色苷类，还含有脂肪酸、多糖、蛋白质、微量元素、维生素及香气物质等多种成分[1—4]。此外，对牡丹花瓣中重要成分的提纯工艺研究也有报道。王晓等[5—6]利用超声提取和酶解法建立牡丹花总黄酮的最佳提取工艺；刘建华等[7]利用GC-MS研究牡丹开放时期鲜花中的挥发性成分，通过对菏泽多个牡丹品种的花混合蒸馏，共鉴定出 49 种化合物。周海梅等[8]应用顶空固相微萃取技术对洛阳 10个牡丹品种花瓣提取并鉴定出34种挥发性成分。Li等[1]利用顶空固相微萃取法结合 GC-MS技术从 30个牡丹品种花瓣中共检出168 种挥发性成分，其中多数是萜烯类、醇类和烷烃类，也含有少量酮类、醛类、酸类和其他化合物。李双[9]以菏泽牡丹花为原料建立牡丹精油最佳提取工艺为蒸馏时间4 h、液料比15 mL·g–1、氯化钠浓度5%；还建立了超高压提取牡丹花精油最佳工艺条件，提取率达 0.7265%。张志超等[10]比较了温浸提取、回流提取、超声提取凤丹牡丹中的花青素工艺，确定超声提取花青素效率最高，工艺稳定。周畅等[11]利用有机溶剂萃取白牡丹干花成分，共检出78种化合物，其中烷烃类化合物占比最大达51.30%。吴晓莹[3]发现牡丹花瓣中的脂肪酸主要包括硬脂酸、十六烷酸和亚油酸，含有微量的α-亚麻酸。上述研究均为盛开时的牡丹花，对不同发育时期花瓣中挥发性成分合成与积累规律的研究尚未见报道。

此外，关于牡丹花朵发育进程中小分子挥发物的积累规律及未开放的花朵蒸馏工艺研究较为匮乏。尤其是近年来，由于牡丹花蕊茶的热销，引起研究者对未开放花朵挥发性成分的关注。未开放花苞是摘取花蕊的最佳原料，随之而来的是花瓣在摘取之后变成了废弃物，造成较大资源浪费，因此将其进行蒸馏获得牡丹花露，用于护肤及食品领域可充分发挥其价值。到目前为止，对牡丹花瓣蒸馏获得挥发性成分的含量均为相对含量(峰面积法，数值是94.78%)[12]，对绝对含量了解甚少，不利于作为原料进行精确添加。因此，本研究以凤丹不同发育时期的花为材料，通过设置料液比及蒸馏时间进行正交实验设计，研究其花瓣挥发性成分积累规律与蒸馏工艺，为其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

利用凤丹牡丹大风铃期(S1)、圆桃期(S2)和破绽期(S3)三个发育时期的花瓣为原料[13]，对应花瓣颜色分别为绿色、浅黄色及白色，均为花朵开放(盛花期)之前采样，去掉花蕊，清洗干净，用于后续蒸馏。

1.2 含水率测定

称取不同时期的花瓣鲜重，烘干至恒重后称重，计算含水率。

1.3 水蒸气蒸馏

利用三因素三水平正交试验设计 9个处理(表1)，其中三因素三水平分别是发育时期(S1～S3)、料液比(花瓣鲜重与纯净水重量比设为1:1、1:2和1:3)、蒸馏时间(1 h、2 h和3 h)。蒸馏设备购自成都普检仪器有限责任公司(TX05-02G)，先用电磁炉(1000 W)加热至有水蒸气出现后调至800 W进行蒸馏，蒸馏压力为常压，蒸馏温度 100℃，收集蒸馏后冷凝的澄清透明液体，即牡丹花露，用于后续分析。

表1 用于牡丹花水加工工艺正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design of peony flower extraction processing technology

1.4 GC-MS检测方法

固相微萃取采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头，购自美国Sigma公司(Lot: 139108)。试验前萃取纤维头在气相色谱进样口于 250 ℃老化两次，每次0.5 h，清洗2次。色谱条件：HP-5MS(30 m × 250 μm × 0.25 μm)弹性石英毛细管柱；载气He，不分流(样品 1、5、9、11、15和16)或者2V1分流(样品 21、22和 26)，恒流 1.0 mL·min–1；进样口温度250 ℃；柱温：初温40 ℃，恒温2 min，以 2 ℃·min–1速率升温至 152 ℃，保持 2 min，然后以 20 ℃·min–1升温至 310 ℃，保持 0 min，运行310 ℃，2 min。质谱条件：EI离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度280 ℃，电子能量为70 eV，扫描范围为30～500 amu。取5 mL 牡丹花露置于20 mL棕色螺口玻璃顶空瓶中，用50/30 μm萃取纤维头于瓶内萃取30 min后取出，在 GC-MS进样口 250 ℃解析 3 min，进行GC-MS(HP7890 B/7000 C型，美国安捷伦科技公司)测定。

定性标品为正构烷烃C7-C40，定量标品为二辛醇(浓度 0.0072 mg·mL–1)。通过在相同条件下加入的C7-C0保留时间计算保留指数(RI)。

利用 Agilent G1701DA MSD Productivity ChemStation软件对GC-MS检测结果进行分析，对采集到的质谱图用NIST05.L和RTLpest.L谱库进行分析，对照标品峰面积，采用>0.03%进行积峰，并根据标品进行浓度计算，确定牡丹花露中挥发性成分的浓度及百分含量。

1.5 统计分析与作图

采用 SPSS软件单因素方差分析进行差异显著性分析，采用协方差矩阵进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，计算主成分特征值；采用R软件进行统计分析。采用Excel和TBTools软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同发育时期花瓣特征及含水率

对三个发育时期的凤丹牡丹花瓣随机称取测定鲜重和干重，计算含水率。结果表明，S1期含水率最高、S2期含水率最低，随着花朵发育进程，花瓣由绿逐渐变黄到白，含水率S2期先降低S3期再升高(表2)。

表2 不同发育时期凤丹花瓣生物量Table 2 The biomass of petals at different developmental stages of Paeonia ostii

2.2 不同发育时期不同蒸馏工艺的牡丹花水中化合物种类及含量分析

三个不同发育时期，采用不同蒸馏工艺在 9个样品中共鉴定出145个挥发性成分，其中S1期得到 96个化合物(样品 1为 70个，样品 5为 54个，样品9为47个)；S2期检测到56个化合物(样品11为53个，样品15为47个，样品16为46个)；S3期检测到48个化合物(样品21为48个，22和26中均为47个)(表3)。上述挥发性成分归为 8大类，分别是醇类、醛类、酸类、萜烯类、酮类、烷烃类、酯类和其他类；对各类百分含量进行统计分析，结果如图1。从总体发育进程来看，发育早期(S1，样品1、5、9)花瓣蒸馏后检测到化合物占比最大的是其他类化合物，中后期(S2和S3)花瓣蒸馏后化合物占比最大的是烷烃类。从蒸馏工艺来看，不同料液比和蒸馏时间处理，不同种类化合物占比会有所差异。这说明随着花蕾长大与花瓣伸长，被检测到的挥发性成分逐渐减少，但含量逐渐增加。

图1 凤丹花瓣不同提取物样品中8类化合物的百分含量Fig. 1 The percentage of 8 kinds of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals

表3 凤丹花瓣不同提取物样品中化合物数量Table 3 The number of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals

发育早期(S1)花瓣采用不同料液比和蒸馏时间提取，发现共同存在的化合物有24个，在样品1、5、9中单独出现的化合物分别有21、10和12个(表3)，基本都在样品1中含量最高(表4)。总体来看，在发育早期(S1)，蒸馏提取牡丹花瓣中的化学成分，以1:1液料比和蒸馏1 h(样品1)获得牡丹花露成分及含量最高。

表4 凤丹花瓣不同提取物样品的同类化合物含量比较(mg·L–1)Table 4 Comparison of content of compounds in different extraction samples of Paeonia ostii petals (mg·L–1)

发育中期(S2)花瓣采用不同料液比和蒸馏时间，发现共同存在的化合物有40个，在样品11和15单独出现的化合物分别有8个和2个，样品16中没有单独出现的化合物(表3)。样品16中的化合物含量比样品11和样品15高(表4)。烷烃类是在三个样品中占比出现先升高后降低趋势，样品15中最高(料液比1:2；蒸馏3 h)；酯类、醇类均比样品11占比高；萜烯类逐渐增加，在样品16中达到最高(料液比1:3，蒸馏1 h)(表4)。综合考虑，S2期以1:3料液比和蒸馏1 h(样品16)的工艺最佳。

发育后期(S3)花瓣采用不同料液比和蒸馏时间处理，发现共有化合物44个。在样品21中单独出现的化合物有1个，样品22和样品26中均没有单独出现的化合物(表3)。样品21和样品22中的化合物含量多数比样品26高，说明料液比和蒸馏时间的处理工艺对化合物种类变化影响不大，但对化合物提取含量有较大影响。S3期花朵挥发性化合物中不同种类占比与前两个时期(S1、S2)有较大不同，但含量均比前两个时期高。占比最高的是烷烃类，在S3期达 41%(样品 22)；其次是醛类，占比 32%(样品 22)；此外，其他类占比达 23%(样品 22)；样品21、22、26中，醛类、醇类、萜烯类、酮类占比逐渐降低，烷烃类逐渐增加，其他类在样品22和 26均比21高(表4)。综合考虑化合物的成分及含量，S3期花朵蒸馏提取以料液比1:2和蒸馏1 h(样品22)的工艺最佳。

将 9个样品中各类化合物进行分类及含量加和平均，差异显著性分析表明，S1和S2期醇类、醛类、酮类、烷烃类、酯类、其他类化合物没有显著差异，S3期与前两个时期差异显著，且含量均高于 S1和 S2期。从各类化合物提取含量来看，样品 22最佳，即 S3期花瓣，利用1:2料液比，在蒸馏1 h的提取物所含化合物种类及含量均较优(表4)。

2.3 不同工艺主成分分析与聚类分析

将获得的 9个样品的挥发性化合物进行主成分分析，提取出9个主成分，其中前三个主成分累计贡献率 79.08%，第一主成分贡献率占39.5%，第二主成分贡献率占 24.5%；第三主成分贡献率为15.0%。9个处理在三个主成分中能很好区分，值得一提的是在 S2和 S3期，各自三个样品能分别聚合在一起，S1期的三个样品分散在两个不同的空间(图2)，表明早期样品加工工艺对挥发性成分影响较大。在获得主成分基础上，对不同处理的主要成分的化合物含量进行聚类和热图分析(图3)，结果表明同一发育时期，不同料液比和蒸馏时间，所获得化合物聚类在一起，但S1期不同加工工艺对挥发性成分有一定影响，不同料液比与蒸馏时间处理化合物成分和含量差异较大。

图2 凤丹花瓣9个提取物样品主成分三维空间分布Fig. 2 Three-dimensional spatial distribution of principal components of 9 extraction samples of Paeonia ostii petals

图3 凤丹花瓣9个提取物样品中化合物聚类分析Fig. 3 Cluster analysis of compounds in 9 extraction samples of Paeonia ostii petals

3 结论与讨论

从凤丹牡丹3个发育时期的花瓣中，通过不同蒸馏工艺共鉴定出 145个挥发性成分，早期(S1)花瓣中的化合物种类丰富，后期(S2和S3)花瓣中的化合物含量比较高。检测到的挥发性成分归为8大类，分别是醇类、醛类、酸类、萜烯类、酮类、烷烃类、酯类和其他类。S1期花瓣检测到化合物占比最大的是其他类，中后期(S2和S3)占比最大的是烷烃类。从蒸馏工艺来看，同一发育时期，不同料液比和蒸馏时间处理，提取的挥发性成分中不同种类化合物占比及含量会有差异。综合整体测定结果，S1期的工艺选择料液比1:1、蒸馏1 h提取的花露挥发性成分种类和含量较高，S2和S3期花瓣的提取工艺分别选择料液比 1:3和 1:2、蒸馏 1 h为最佳。

在凤丹不同发育时期的花瓣中，发现较多具有重要应用价值和广泛发展前景的化合物。在S1时期单独出现的化合物有14种，如α-松油醇，具有广泛的用途，其广泛存在于植物油中，具有多种抑菌活性[14]，也是重要的香料成分，同时也是鱼腥草的功效成分之一[15]，并广泛用于日化和食用香精。在S2时期，单独出现的化合物有9种，其中 1,2-二羟基萘、2-环己烯醇含量最高，其次为十四酸乙酯，该化合物可用于日化香精；还检测到少量的对二甲苯和亚油酸，对二甲苯是聚酯工业的重要原料[16]，亚油酸具有降低血脂、预防或减少心血管病的发病率，特别是对高血压、高血脂冠心病等功效[17]。在S3时期单独出现的化合物有16种，其中3,7-二甲基-1-辛醇在样品22中含量很高，该化合物别名乙酸玫瑰酯，具有玫瑰香气，在香水及其他香精中可作为增香剂[18]。橙花醇是花香气重要成分，在凤丹盛花期花瓣中没有检测到[1]，本研究在S1和S2期也没有检测到橙花醇，在S3期则检测到高含量的橙花醇，又以样品21 (料液比1:1，蒸馏3 h)含量最高；橙花醇亦是一种贵重的香料成分，对微生物具有一定抑制效果，可用于消毒剂和护肤品[19]。另外，3-蒈烯是凤丹重要的香气成分，并与芍药香气一致[20]，仅在S3期花瓣中检测到，且在样品22含量最高(料液比1:2，蒸馏1 h)。因此，选择合适的发育时期和优化的蒸馏工艺可以捕捉到关键化合物，并作为后期产品开发的特征风味化合物。

自从牡丹花瓣被批准为新资源食品原料以来，幼嫩花蕾及未开放的花蕾(S1～S3期)常用于摘取花蕊制作花蕊茶，其花瓣则作为废渣丢弃。为了充分利用牡丹花瓣资源，本研究将凤丹花蕾制作花蕊茶后剩余的花瓣进行蒸馏，对其小分子化合物成分、含量及蒸馏工艺进行系统研究，获得多个重要的挥发性成分，并确定不同发育时期花瓣的最佳蒸馏工艺，可为后期产品开发提供科学依据。