刘瑞华，徐礼生

(1.新宇药业股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

不同金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌活性影响的研究

刘瑞华1，徐礼生*2

(1.新宇药业股份有限公司，安徽 宿州 234000；2.宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

研究Na+、K+、Ca2+、Ba2+和Mg2+五种金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌活性的影响。结果表明：Mg2+、Na+对天冬氨酸酶的活性起促进作用，Ba2+、Ca2+对天冬氨酸酶活性起抑制作用，K+对酶的活性未有明显变化，其中物质的量浓度为1.5×102-mol/L的Mg2+催化作用最好，Ba2+的抑制作用最明显，且Ba2+和Ca2+离子浓度在5×10-3mol/L～35×10-3mol/L的范围内，酶活性逐渐降低。

金属离子；L-天冬氨酸；基因工程菌；转化率

L-天冬氨酸又称α-氨基丁二酸，是一种常见的酸性氨基酸，在食品、医药、美容、材料及化工等方面有着非常广泛的用途[1-2]，在食品工业方面L-天冬氨酸常用于营养增补剂和甜味剂的合成，添加于各种清凉饮料，是糖代用品阿斯巴甜主要生产原料[4]。L-天冬氨酸酶在日本开始趋于工业化的生产[5]，我国在20世纪80年代后期开始进行L-天冬氨酸的工业化生产。利用L-天冬氨酸酶催化反丁烯二酸与氨水发生加成反应得到的，有游离整体细胞法和固定化酶法两种方式，在此实验中用游离整体细胞法进行实验，具有工艺简单，酶活力高且设备投资少等优点，该法是现代生产L-天冬氨酸的工艺。

本实验通过天冬氨酸酶基因工程菌制备天冬氨酸，探究不同金属离子对天冬氨酸酶活性的影响，从而为L-天冬氨酸工业化生产奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

L-天冬氨酸标准液(1 % pH值7.5～8)、反丁烯二酸、氨水、酵母浸粉、鱼粉蛋白胨、乳糖、冰醋酸、正丁醇、茚三酮，NaCl、KCl、BaCl2、CaCl2、MgCl2。WT-ZNO型洁净工作台，高压蒸汽灭菌锅；离心机等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种处理

本实验所用的菌种为重组大肠杆菌，现于宿州学院微生物实验室保存。将上述菌种按3.3%的接种量即100 μL菌液和7 μL氨苄接种于灭菌过的2支LB培养基中，在37 ℃、170 r/min的条件下摇床振荡培养10 h，为第一代菌液。重复上述操作活化三代，将上述发酵好的菌液放入500 mL的离心管中，在转速为8000 r/min的离心机中离心10 min,弃去上清液，将剩下的菌体放置橡皮管中于-20 ℃的冰箱中冷冻保藏备用。

1.2.2 L-天冬氨酸酶酶活测定

称取反丁烯二酸5 g,加入适量蒸馏水搅拌均匀，缓慢的加入氨水至反丁烯二酸溶解，再调节pH到7.5～8后定容至100 mL于容量瓶中待用，即得到5 %的富马酸铵溶液，将上述离心后得到的菌液少量的接种到橡皮管内，在37 ℃、170 r/min的摇床条件下分别培养3 h、5 h、7 h、9 h和11 h，然后通过高效液相色谱法测定酶的活性。

1.2.3 不同金属离子对L-天冬氨酸酶活性的影响

金属离子包括Na+、K+、Ca2+、Ba2+、Mg2+五种，配置成不同浓度，通过测定L-天冬氨酸的产率来比较金属离子对酶活性的影响。

2 实验结果与讨论

2.1 酶活的测定

图1 层析法测定酶活

由图1可以直观的看出点样的点出现并和标准样天冬氨酸一致，即活化的菌种有活性，且摇床三小时就有活性，所以后面的实验全部都是在恒温摇床活化3个小时下进行的。

2.2 不同浓度的金属离子对L-天冬氨酸酶活性的影响

由图2可以看出Na+在一定浓度范围内对L-天冬氨酸酶具有促进作用，在0～15×10-3mol/L浓度范围内，天冬氨酸酶的相对酶活逐渐增加，达到最大值110%，随着浓度的增大相对酶活降低，后达到最低值65 %。

由图3可以看出K+在0～5×10-3mol/L内基本无大变化，说明在低浓度范围钠离子对天冬氨酸酶酶活基本无影响，后随着浓度的增大，天冬氨酸酶的相对酶活逐渐降低至72%。

图2 钠离子对天冬氨酸酶影响

图3 钾离子对天冬氨酸酶影响

由图4可知，随着Ba2+浓度升高酶活性降低，在浓度为35×10-3mol/L下达到最低值45 %。Ba2+对天冬氨酸酶有一定抑制作用。

图4 钡离子对天冬氨酸酶影响

由图5可以看出，随着Ca2+离子浓度的增加，天冬氨酸酶的相对酶活逐渐降低，但变化不是很明显，在0～20×10-3mol/L浓度范围内天冬氨酸酶的活性基本无明显变化，后随着浓度的变化，天冬氨酸酶的活性下降。

图5 钙离子对天冬氨酸酶影响

由图6可以看出Mg2+0～20×10-3mol/L浓度范围内，天冬氨酸酶的相对酶活增加，且浓度10×10-3mol/L时达到最大值145 %，后随着浓度的增大酶活逐渐降低。

图6 镁离子对天冬氨酸酶影响

3 结论

Mg2+的激活作用最明显，浓度在10×10-3mol/L可使酶活提高45 %，其次是Na+，在5×10-3～20×10-3mol/L浓度范围内对天冬氨酸酶有激活作用，后随着浓度升高，酶活性逐渐降低。在低浓度下可以看出K+对酶活无明显的影响，Ba2+和Ca2+对酶活均有抑制作用，且随着浓度的升高，酶的活性越来越低，且Ba2+对天冬氨酸酶活性抑制更加明显，在35×10-3mol/L浓度下天冬氨酸酶活性降低至45 %。

[1] 郝大伟, 裘娟萍. 生物催化富马酸加氨合成天门冬氨酸的研究进展[J].氨基酸和生物资源, 2008, 30(2): 39-43.

[2] 姚洪齐,徐 晨. N-甲酰-L-天冬氨酸酐的合成研究[J].广州化工, 2014, 42(3): 28-30.

[3] 林应锐. 阿斯巴甜的生物合成[J].微生物学通报, 1992, 19(4): 226 - 229.

[4] Atkinson R O. Mannich bases of acylaminonates and synthesis of DL-aspartic acid[J].J Chem Soc, 1952, 3: 3317-3318.

[5] Tosa T,Sato T,Mori T,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yamamoto%20K%5bAuthor%5d&cauthor=true&cauthor_uid=385076et al. Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenen as matrix[J].Biotechnol Bioeng. 1979, 21(10): 1697-1709.

StudyontheEffectsofDifferentMetalionsontheActivityofAspartaseGeneEngineeredBacteria

LiuRuihua1，XuLisheng2

(1. Xinyu Pharmaceutical Co., Ltd., Suzhou 234000,China； 2. Department of Life and Food Science, Suzhou University,Suzhou 234000, China)

In order to study the effects of different metal ions on the activity of aspartase gene engineering bacteria. The effects of Na+, K+, Ca2+, Ba2+and Mg2+on the activity of aspartase gene engineering bacteria were studied by using Fumaric acid and ammonia to catalyze the production of L-aspartic acid. The activity of the enzyme was determined by HPLC. The results showed that Mg2+and Na+could promote the activity of aspartase, and Ba2+and Ca2+could inhibit the activity of aspartase. The activity of the enzyme did not change significantly. The Mg2+catalysis is the best, and the Ba2+and Ca2+ions are in the range of 5 ×10-3mol/L～35×10-3mol / L, and the concentration of Ba2+and Ca2+is 1.5 × 10-2mol / L.

metal ion; L-aspartic acid; gene engineered bacteria; conversion rate

2017-09-23

安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2017A440)；安徽省质量工程项目(2015zjjh034、2015ckjh108、2016jyxm1038)

刘瑞华，高级工程师，主要从事微生物与生化药学研究。

TQ464.7

A

1008-021X(2017)22-0009-02

(本文文献格式：刘瑞华，徐礼生.不同金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌活性影响的研究[J].山东化工，2017，46(22)：9-10.)