洪翠云，林廷好，高建设，林 曦，王国英，郑明芬

(1. 福建省亚热带植物研究所 / 福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006；2. 厦门茶叶进出口有限公司，福建 厦门 361013；3. 武夷山市戏水岩茶业有限公司，福建 武夷山 354302)

武夷岩茶是我国传统名茶，属于半发酵的乌龙茶类，以其“岩骨花香”的独特韵味享誉海内外。2006年，“武夷岩茶(大红袍)制作技艺”被列入首批国家级非物质文化遗产代表性项目名录，其传统独到的制作技艺主要在做青和焙火两道工序[1—2]。武夷岩茶传统烘焙常以炭火为热能，有“武夷焙法，实甲天下”的美誉[2]。乌龙茶精制过程中的焙火工艺，可以促使在初制完成时形成的内含物质在热的作用下经美拉德反应、氧化降解等进一步发展，从而为终端产品感官品质奠定物质基础。香气是影响乌龙茶品质的重要因子之一，在乌龙茶感官审评中权数为 0.30，仅次于滋味因子的 0.35[3]。Feng等[4]研究表明，利用同一茶树品种相同原料加工制成的六大茶类中，乌龙茶类挥发性组分的数量居六大茶类之首。近年来，关于电热焙火工艺对乌龙茶挥发性组分及品质的研究多有报道，且在挥发性代谢物的提取上存在蒸馏萃取法(SDE)、固相微萃取法(SPME)、顶空进样法(HS)等多种方式[5—6]。陈林等[7]比较了蒸馏萃取法(SDE)和顶空固相微萃取法(HS-SPME)对乌龙茶香气组分的萃取效率，以HS-SPME干样萃取法检出成分的种类最多。目前，HS-SPME结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)在茶叶香气组分的检测中应用广泛，技术较为成熟，且具有操作简单、灵敏度高、无需采用有机试剂且重现性好等优点[8]。本研究采用 HS-SPME结合GC-MS技术，以武夷岩茶当家茶树品种肉桂(Camellia sinensis‘Rougui’)鲜叶制成的乌龙茶为试材[9]，探讨武夷岩茶炭焙工艺对肉桂乌龙茶挥发性组分及香气品质的影响。

1 材料与方法

1.1 茶样制备

2020年5月初，采摘自武夷山市行政区域范围内肉桂茶树品种中等开面新梢茶青原料，按武夷岩茶传统制作技艺初制成毛净茶，并依据武夷岩茶精制习惯，前后经3轮炭焙、退火，取不同炭焙程度实验样品。经过一轮炭焙的实验样品，其成茶火功风格为轻火(QH)；经过二轮炭焙的实验样品，其成茶火功风格为中火(ZH)；经过三轮炭焙的实验样品，其成茶火功风格为高火(GH)。不同炭焙程度实验样品，分别重复3次取样。

肉桂乌龙茶初制、精制实验均在武夷山市戏水岩茶业有限公司进行。焙窟直径58 cm、深度35 cm，使用荔枝炭，放炭量50 kg，焙茶量4 kg。炭焙工艺参数见表1。

表1 武夷肉桂乌龙茶炭焙工艺参数Table 1 Charcoal baking process parameters of Wuyi Rougui oolong tea

1.2 仪器与试剂

球磨仪，型号MM400(Retsch公司)；电子天平，型号MS105DU(METTLER TOLEDO公司)；萃取头，型号 120 μm DVB/CAR/ PDMS(Agilent公司)；固相微萃取装置，型号SPME AllowCond(CTC Analytics AG公司)；老化装置，型号 Fiber Conditioning Station(CTC Analytics AG公司)；样品加热箱，型号Agitator(CTC Analytics AG 公司)；GC-MS，型号8890-5977B(Agilent公司)；色谱柱，型号 DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)(Agilent公司)。

氯化钠分析纯(国药集团)；正已烷色谱纯(Merck公司)；氘代苯乙酮(上海玉博)。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

取出样品进行液氮研磨，涡旋混合均匀，称取0.6 g于顶空瓶中，分别加入1 mL饱和NaCl溶液、10 μL 50 μg·mL–1氘代苯乙酮溶液，并进行全自动顶空固相微萃取(HS-SPME)。

全自动顶空固相微萃取条件：在100 ℃恒温条件下，震荡5 min，而后将120 µm DVB/CAR/ PDMS萃取头插入样品顶空瓶，顶空萃取15 min，于250 ℃下解析 5 min，并进行 GC-MS分离鉴定。120 µm DVB/CAR/ PDMS萃取头在首次萃取前，于GC进样口中老化2 h，之后每次使用前加热老化5 min。

1.3.2 色谱、质谱采集条件

色谱条件：DB-5MS 毛细管柱(30 m × 0.25 mm ×0.25 μm，Agilent J&W Scientific, Folsom, CA, 美国)，载气为高纯氦气(纯度不小于 99.999%)，流速1.0 mL·min–1，进样口温度 250 ℃，不分流进样，溶剂延迟3.5 min。程序升温：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃·min–1升至 100 ℃，再以 7 ℃·min–1升至 180 ℃，最后以 25 ℃·min–1升至 280 ℃，保持 5 min。

质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质谱接口温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围(m/z) 50～500 amu。

1.3.3 挥发性组分定性定量分析

GC-MS分析获取的原始数据由 MassHunter软件(Agilent)进行峰提取，获得特征峰的质荷比、保留时间和峰面积等信息，并对原始数据进行以下处理：保留指数计算；对单个Peak过滤，只保留单组空值不多于 50%或所有组中空值不多于50%的峰面积数据；数据标准化及归一化处理。在结合 NIST、Wiley等公共数据库的基础上，建立MWGC 数据库。采用 Qualitative Analysis Workflows B.08.00软件，并基于MWGC数据库，根据质荷比、保留时间和峰面积等信息，对样本挥发性成分进行定性定量分析。图1为不同质控样本QC总离子流图(Total ions current，TIC)的重叠图。质控样本(QC)由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同处理下的重复性。TIC为每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱，TIC重叠图可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。

图1 不同质控样本QC总离子流图TIC重叠图Fig. 1 Overlapping images of QC total ion current (TIC) for different quality control samples

1.3.4 数据处理

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)采用 R软件(www.r-project.org/)的内置统计 Prcomp函数，设置参数 scale=True，以对数据进行 Unit variance scaling(UV)归一化；通过R软件Pheatmap包绘制热图，对挥发物在不同样本间的组成模式进行聚类分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结合了正交信号矫正(OSC)和 PLS-DA方法，在原始数据进行 log2转换后，再进行中心化处理(Mean Centering)，利用R软件中的MetaboAnalyst R包OPLSR.Anal函数进行计算分析。对OPLS-DA进行排列检验模型验证，其P值均小于0.005，表示模型可靠，不存在过拟合现象。

2 结果与讨论

2.1 不同炭焙程度肉桂乌龙茶挥发性组分轮廓分析

实验共检测到样本挥发性成分443个，其中包括96个杂环化合物、81个酯类化合物、31个萜类化合物、42个芳香烃类化合物、55个酮类化合物、24个其它烃类化合物、35个醇类化合物、24个醛类化合物、15个酚类化合物、14个胺类化合物、10个酸类化合物、5个含氮化合物、3个含硫化合物及其他化合物。

主成分分析是一种无监督模式识别的多维数据统计分析方法，常用来研究通过少数几个主成分以揭示多个变量间的内部结构[10]。通过对不同炭焙处理肉桂乌龙茶挥发性组分主成分分析显示，不同炭焙处理的样本趋向分离，而相同炭焙处理的样本趋于聚合，且质控样本位于坐标图的正中间位置，说明本实验样本处理具有代表性，且定量定性过程稳定可靠(图2)。其中，第一主成分PC1、第二主成分PC2分别解释了样本64.39%、12.77%的变异率。根据炭焙程度从低到高，样本在第一主成分方向(X轴)上从左到右依次分布，说明炭焙程度是影响肉桂乌龙茶挥发性成分变化的重要因素。

图2 不同炭焙处理肉桂乌龙茶挥发性组分的主成分分析得分Fig. 2 PCA score plot of the volatile components in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

聚类分析同样显示，同一炭焙程度的样本(组内)首先聚集在一起，其次再与邻近炭焙程度的样本(组间)聚集，与主成分分析结果基本一致(图3)。

图3 不同炭焙处理肉桂乌龙茶及质控样本挥发性组分聚类分析Fig. 3 Heat map of the volatile components in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

2.2 不同炭焙程度肉桂乌龙茶与对照挥发性组分的差异分析

基于 OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA 模型的变量重要性投影(Variable importance in projection, VIP)，初步筛选出不同处理间的差异挥发性组分，同时结合单变量分析的P值及差异倍数值进一步筛选出差异挥发性组分。本研究中，同时满足VIP≥1、差异倍数值≥2或≤0.5，且P<0.05的 296个代谢物被筛选为差异挥发性组分，占所检测的挥发性组分总数的66.82%，其中包括75个杂环化合物、45个酯类化合物、22个萜类化合物、33个芳香烃类化合物、37个酮类化合物、14个其他烃类化合物、16个醇类化合物、15个醛类化合物、13个酚类化合物、9个胺类化合物、4个含氮化合物、1个含硫化合物及其他，说明焙火工艺是乌龙茶挥发性成分含量高低的重要影响因素。乌龙茶精制烘焙过程中，在高温作用下，茶叶内含物质发生系列复杂反应，如焦糖化反应、美拉德反应、氧化及热裂解、异构化等[11]。其中，美拉德反应是高温条件下茶叶中游离氨基酸及蛋白质热裂解产物游离胺等与糖类物质热裂解产生的醛、酮等羰基化合物发生缩合环化等的反应；而在没有氨基化合物存在时，糖类物质受高温作用发生脱水、缩合、聚合反应，最后形成黑褐色物质，即焦糖化反应[12]。

以毛净茶(MT)为对照，与不同炭焙处理的肉桂乌龙茶挥发性组分做两两比较分析，包括 MT与QH(图4: A)、MT 与 ZH(图4: B)、MT 与 GH(图4: C)比较。差异挥发性组分火山图充分展示了挥发性组分在两组样品中的表达水平差异，及差异的显著性(图4)。图4显示，在MT与QH比较中，总的差异挥发性成分达154个，其中包括上调挥发性成分152个及下调挥发性成分2个；而在MT与ZH及MT与 GH的比较中，相应的化合物数量分别是 233、220、13及284、257、27。两两比较差异挥发性组分火山图表明，以毛净茶(空白处理)为对照，随炭焙程度增加，肉桂乌龙茶总的差异挥发性成分数量增加，且含量水平显著上调的差异挥发性成分数量显著高于下调的差异挥发性成分。同时，值得注意的是，随着炭焙程度增加，含量水平显著上调的挥发性成分数量与显著下调的挥发性成分数量同时增加，说明烘焙工艺在香气物质积累的同时，也存在部分香气物质的损失。据Feng等[4]研究，茶叶加工过程中形成香气的重要途径为三类：1)美拉德反应及氨基酸和烃类(碳氢化合物)的降解；2)酶介导的氧化和水解；3)非酶促降解和氧化。Chen等[13]在乌龙茶贮藏过程中采用定期复焙的管理方式，发现在热的作用下，黄酮苷类物质水解、长链醇类和酸类物质发生降解，并生成吡咯类物质。徐邢燕等[14]在探讨不同烘焙程度武夷肉桂乌龙茶品质差异时报道，中火茶13个氨基酸组分含量均极显著低于轻火茶。陈泉宾等[15]、江山等[16]研究亦表明，乌龙茶精制烘焙工艺使茶叶中茶多酚、氨基酸含量显著减少，而糖类物质则减少不显著甚至增加，进一步说明黄酮苷类物质在热的作用下发生水解，释放出苷类配基(糖类物质)及醇类芳香物质，弥补了烘焙过程中美拉德反应底物糖类物质的消耗，使其减少不明显甚至增加。而黄酮苷类物质、脂肪酸及氨基酸/糖类均是茶叶中重要的香气前体物质[4]。在乌龙茶加工中，因为茶叶中酶活性在初制工艺时已基本被破坏，因此，精制烘焙过程中，在热的作用下，香气物质的积累主要来自美拉德反应等热化学作用及非酶促的降解和氧化，如黄酮苷类物质的水解等。

图4 挥发性组分在两两比较中的火山图分析Fig. 4 Volcano map analysis of volatile components in paired comparisons

2.3 挥发性组分K均值聚类分析

为了研究挥发性组分在不同样本中的相对含量变化趋势，将296个差异挥发性成分相对含量进行标准化处理和中心化处理，然后进行 K均值聚类(K_means)分析。按变化趋势不同，296个差异挥发性成分被划分为12个类别，其中包括随炭焙程度增加含量逐渐升高的Sub Class 1、2、3、6、7、8、10，及随炭焙程度增加含量逐渐降低的 Sub Class 5(图5)。数据显示，随炭焙程度增加含量显著升高的差异挥发性成分数量达232个，而含量显著降低的差异挥发性成分数量为29个。在随炭焙程度增加含量升高的差异挥发性组分中，不同类别物质的数量及其占所在物质类别差异挥发性组分总数的比例分别为：杂环化合物 60个(80.00%)、酯类 39个(86.67%)、萜类 18个(81.82%)、芳香烃类 26个(78.79%)、酮类 31个(83.78%)、其他烃类 10个(71.43%)、醇类7个(43.75%)、醛类11个(73.33%)、酚类11个(84.62%)、胺类8个(8.89%)、含氮化合物4个(100.00%)及含硫化合物1个(100.00%)等；在随炭焙程度增加含量降低的挥发性差异代谢物中，不同类别物质的数量及其占所在物质类别差异代谢物总数的比例分别为：杂环化合物4个(5.33%)、酯类2个(4.44%)、萜类 3个(13.64%)、芳香烃类 4个(12.12%)、酮类1个(2.70%)、其他烃类1个(7.12%)、醇类6个(37.5%)、醛类3个(20.00%)、酚类1个(7.69%)等。研究显示，绝大多数物质随着炭焙程度增加含量显著升高。美拉德反应所产生的挥发性化合物可以归为三类：糖的脱水、降解产物，包括呋喃、吡喃酮、环戊烯、羰基化合物和酸；氨基酸降解产物；Strecker降解反应产生的醛类化合物、硫化物；化合物间进一步反应所得到的香气化合物，如吡咯、吡啶、咪唑、吡嗪、恶哗、噻唑和羟醛化合物[17]。肉桂乌龙茶中随炭焙程度增加，含量显著升高的差异代谢物包括2,3,5-三甲基呋喃、2-甲基苯并呋喃、戊基呋喃、α-糠醛-α-呋喃甲胺、2-乙烯基- 3-乙基吡嗪、3,5-二乙基甲基吡嗪、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、乙基吡嗪、乙酰吡嗪、5-甲基糠醛、2-羟甲基苯并咪唑、2-(3-噻吩基)吡啶、3,5-二甲基-1-丁基吡唑、3,4-二氢-6-甲基-2H-吡喃、2,5-二甲基嘧啶、异喹啉等。吡嗪类、糠醛类衍生物，及吡咯类、喹啉类、吡啶类等均是茶叶中具有烘炒香的物质[12]。随炭焙程度增加，以醇类物质增加数量的比例最低，降低数量的比例最高，其中，乌龙茶中含量丰富的具有花果香气的香叶醇、反式-橙花叔醇、植物醇(Sub Class 5)随烘焙程度增加含量显著降低。此外，(E)-3-己烯醇(Sub Class 6)随炭焙程度增加，含量显著增加。前人研究表明[12]，茶叶加工过程中，随温度升高，低沸点的具青草气的顺-3-己烯醇(又名青叶醇)在挥发的同时，部分由于异构化作用，形成具有清香的(E)-3-己烯醇(反式青叶醇)，说明乌龙茶精制烘焙过程中，在热的处理下，部分挥发性代谢物发生了异构化。吲哚是乌龙茶中含量丰富且具有清新花香的呈香物质，其含量随炭焙程度增加而显著降低。这与Yang等[18]在咖啡豆烘焙中的研究一致，吲哚可以作为轻度烘焙咖啡的挥发性标记物。

图5 不同炭焙处理肉桂乌龙茶挥发性差异代谢物K_means图Fig. 5 K_means graphs of differential volatile metabolites in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

本研究肉桂乌龙茶中苯甲醛、(Z)-芳樟醇氧化物、水杨酸甲酯随炭焙程度增加，含量显著升高；而香叶醇、反式-橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚则随炭焙程度增加，含量显著降低。姚月明等[19]研究表明，肉桂乌龙茶含有较丰富的香叶醇、芳樟醇及其氧化物，且香叶醇、苯甲醇、2-苯乙醇、顺-3-己烯酸乙烯酯、水杨酸甲酯、苯乙腈和正丁酸等香气成分均高于水仙乌龙茶；近来的研究报道认为，含量较高的香气成分为反式-橙花叔醇、α-法尼烯、苯甲醛、水杨酸甲酯、芳樟醇氧化物、香叶醇、苯甲腈、吲哚等[20]。因此，绝大多数的挥发性差异代谢物含量随炭焙程度增加显著升高，显然并不能代表芳香物质总量的增加。而不同芳香物质的浓度高低，也并不能等同于对茶叶总体香气品质的贡献大小[4]。参考文献资料[4,19—21]，以热图的形式部分展示不同炭焙处理肉桂乌龙茶中含量丰富且重要的挥发性成分的相对含量变化(图6)。

图6 不同炭焙处理的肉桂乌龙茶中含量丰富的挥发性成分Fig. 6 Heat map of the abundant volatile metabolites in Rougui oolong tea with different charcoal baking treatments

3 结论

本研究基于顶空固相微萃取法(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)，探讨武夷岩茶炭焙工艺对肉桂乌龙茶挥发性组分的影响。实验共检测到肉桂乌龙茶挥发性成分443个，经主成分分析及聚类分析显示，焙火工艺是影响乌龙茶挥发性成分含量的重要因子，第一主成分及第二主成分分别解释了样本挥发性组分64.39%、12.77%变异率。不同实验处理挥发性组分与对照的差异分析及K均值聚类分析均显示，随着炭焙程度增加，不同类别物质中多数挥发性代谢物含量随之显著升高，且以美拉德反应产物等具有茶叶烘炒香的吡嗪类化合物、糠醛类衍生物、吡咯类化合物最具代表性；同时，部分含量丰富且具有乌龙茶特殊花果香气的醇类、萜烯类物质如香叶醇、橙花叔醇、植物醇、α-法尼烯等，及具清新花香的吲哚含量显著降低。大多数差异挥发性代谢物含量随炭焙程度增加显著升高，但并不代表芳香物质总量的增加。研究表明，乌龙茶精制烘焙过程中，香气物质的积累主要来自热作用下的美拉德反应及非酶促的降解和氧化，如黄酮苷类水解等。