李嫚嫚 马惠昇，2 穆静

骨骼肌是人体最大的组织，直接参与人体的各项生命活动。而骨骼肌损伤在日常生活中也尤为常见，其中90%的骨骼肌损伤是骨骼肌钝挫伤，是由钝器击打或碰撞引起皮内或皮下以及软组织局部水肿、出血、肌纤维断裂、溶解等为主要改变的闭合性损伤[1，2]。骨骼肌损伤后的修复质量是由肌纤维再生和结缔组织重塑的协调性决定的，瘢痕组织过度增生则会影响整个骨骼肌的收缩功能[3，4]。本研究通过建立日本大耳兔骨骼肌急性钝挫伤模型，观察损伤后不同时间点的腓肠肌组织形态，初步分析以Wnt7a 为代表的非经典Wnt 信号通路表达水平的变化与骨骼肌钝挫伤后修复的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择6月龄日本大耳兔40 只, 体重1.75～2.20kg，雌雄各半，由宁夏医科大学实验动物中心提供，饲养于宁夏医科大学实验动物中心SPF级动物房，常规饲养。

1.2 主要试剂和仪器主要试剂：4%多聚甲醛（上海尚宝生物科技公司）；苏木精-伊红（HE）染液、Trizol、DEPC 水（北京索莱宝科技有限公司）；异丙醇(天津市永大化学试剂有限公司)；HiFiScript 快速去除基因组cDNA 第一条链合成试剂盒[康为世纪（Cat.NO.CW2582M）]；UltraSYBR Mixture 荧光定量试剂盒[康为世纪（Cat.NO.CW0957H）]。

主要仪器：台式高压蒸汽灭菌锅、生物显微镜、图像采集系统（Olympus）、低温离心机、全波长酶标仪（BioTek）、涡旋振荡仪（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems）、生物分光光度计（Eppendorf）。

1.3 骨骼肌急性钝挫伤模型建立自制软组织钝挫伤重力砸伤器，砝码（直径7.0cm,长10cm，质量3kg），固定导管（直径8.0cm，高50cm）。从50cm 处落下，重力29.4N，产生重力势能14.7J。造模前用剃毛器将实验兔右腿内侧皮肤被毛剔除。水合氯醛麻醉后，将实验兔右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，打击部位为右小腿内侧面（其皮下为腓肠肌中段，中心点在跟骨上约7cm 处），将导管垂直置于实验兔距腓肠肌受打击中心表面50cm 高度，砝码在导管上端，沿导管内自由落体下落致一次性打击伤并标记。造模后通过大体观察、触诊及病理学检测，腓肠肌有一定收缩功能障碍且无骨折，属急性腓肠肌钝挫伤模型。砸伤器由同一人操作，以保证打击力度、损伤部位及程度的一致性。

1.4 分组及取材40 只日本大耳兔适应性喂养两周后，随机选取5 只作为对照组，其余35 只制备腓肠肌急性钝挫伤模型，然后随机分为7 组(n=5)，各组分别在造模后1d、2d、3d、4d、5d、7d、14d 取材。取材前，耳缘静脉注射水合氯醛麻醉，解剖并分离左侧腓肠肌，迅速将离体的腓肠肌放在干净的滤纸上均分为2 份，一份置4%多聚甲醛中固定，以备石蜡包埋HE 染色；另一份置-80℃冰箱保存，以备RTPCR 检测。

1.5 腓肠肌组织HE 染色及病理学评价HE 染色光镜观察损伤骨骼肌形态学变化：将腓肠肌组织切成1cm×1cm×0.5cm 大小，用预冷的生理盐水冲洗后放入标记好的包埋盒中，骨骼肌经4%多聚甲醛固定24h 后，石蜡包埋，于腓肠肌肌腹中段处横切5μm 厚的连续薄片，切片脱蜡复水，苏木精染色，1%盐酸-酒精分化，伊红染色，梯度酒精脱水,二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6 RT-PCR 检测Wnt7a mRNA 表达水平从-80℃冰箱取出各组家兔腓肠肌组织约30mg，研磨后加入1ml Trizol 离心管中，充分振荡混匀，静置5～10min；加入0.2ml 氯仿混匀15～30s，然后静置3min；用高速离心机（4℃，12 000rpm 15min）；取水相到新的EP 管中，加入0.5ml 异丙醇，混匀，冰浴10min；离心（4℃，12 000rpm 10min）；倾倒上层液体，用75%冰乙醇沉淀（1ml），混匀；再次离心处理（4℃，12 000rpm 5min）并干燥。加入DEPC 处理水溶解RNA，测浓度，根据逆转录体系调整RNA 浓度并计算逆转录所需上样量，而后逆转录合成cDNA。取1μlcDNA，0.6μl 上、下游引物以及10μl Mix 反应液，并补水至25μl，构建 RNA 逆转录反应体系，行定量PCR 扩增，扩增条件: 95℃ 15min（预变性）、95℃ 10s（变性）、58℃ 30s（退火）、72℃ 30s（延伸）、72℃ 5min（再延伸）共 40 个循环。分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60℃～95℃进行溶解曲线分析。

1.7 引物设计与合成检索根据NCBI GenBank 数据库中Wnt7a 全长基因序列，应用Primer premier 5.0 软件设计出Wnt7a 基因引物，上游引物 P1：5'-GCCAAGGTCTTTGTGGATG-3'；下游引物 P2：5'-AG CAGGTCTTAGTGGTGCA-3'。扩增片段长度157bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，以LSD 法进行组间两两比较。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨骼肌急性钝挫伤后腓肠肌组织变化情况对照组腓肠肌肌纤维呈钝角多边形，形状规则且排列整齐，肌纤维间隙大小一致，肌丝排列整齐，胞核呈圆形或卵圆形，位于肌纤维的周边。与对照组腓肠肌组织相比，钝挫伤后1d 组可观察到肌外膜完整性被破坏、损伤肌细胞变圆肥大，细胞间质中存在大量的红细胞和少量的炎性细胞，部分肌纤维断裂；钝挫伤后2d、3d 组有大量的炎性细胞浸润，肌细胞仍然肿胀明显，并可见空泡组织；钝挫伤后4d 组红细胞较前3d 减少、炎性细胞减少、巨噬细胞增多、肌纤维坏死；钝挫伤后5d 组成纤维细胞增多、细胞排列紊乱；钝挫伤后7d 组肌细胞肿胀减轻，钝挫伤区内可见部分新生肌细胞以及成纤维样细胞，细胞排列紊乱，可见明显的结缔组织填充，炎细胞浸润减轻；钝挫伤后14d 组可见肌丝扭曲，肌纤维明显恢复，纤维化增加，损伤部位初步愈合。见图1。

2.2 急性钝挫伤后骨骼肌Wnt7a mRNA 表达变化RT-PCR 结果显示，家兔骨骼肌钝挫伤在自然恢复过程中，Wnt7a mRNA 表达水平呈逐渐升高的趋势。对照组的平均Cq 值为1.01±0.02，钝挫伤后1d、2d、3d、4d、5d、7d 与14d 组的平均Cq 值分别为1.69±0.17、2.05±0.21、3.83±0.89、6.27±0.99、7.56±1.14、13.55±0.85 与8.22±0.29。与 对照组相比，钝挫伤后1d 和2d 组的平均Cq 值差异无统计学意义（P>0.05），钝挫伤后3d、4d、5d、7d、14d 组的Cq 值差异均有统计学意义（P<0.05）。并且在骨骼肌钝挫伤后Wnt7a mRNA 表达水平逐渐升高，在第7 天表达最高，随后开始下降，钝挫伤后14d 组明显低于钝挫伤后7d 组（P<0.05）。

图1 腓肠肌急性钝挫伤后组织形态学变化（HE 染色，×200）

3 讨论

传统中医认为经筋具有约束骨骼主持运动的功能，《黄帝内经·痿论》：“阳明者，五脏六腑之海，主润宗筋，宗筋主束骨而利关节也。”说明经筋是运动系统的重要组成部分，并对周围组织结构起着保护作用。

现代医学认为骨骼肌钝挫伤主要表现为肌纤维的断裂和肌细胞的溶解，目前研究认为骨骼肌损伤后的修复有三个过程[5，6]：第一个阶段为损伤变性期，在骨骼肌损伤后1～3d 出现，当某些外力因素破坏肌肉的超微结构和周围血管时，导致肌肉内血肿形成，损伤处的肌组织坏死退化，中性粒细胞开始浸润。第二个阶段为修复期，一般出现在骨骼肌损伤后的5～10d，巨噬细胞吞噬坏死的肌组织，损伤肌肉周围的纤维基膜和浆膜间的肌卫星细胞激活、增殖与分化，融合形成新的肌管细胞，伴有毛细血管增生。第三个阶段为肌肉塑形期，瘢痕组织的形成一般在骨骼肌损伤后2～3 周内发生，再生肌纤维分化成熟，受损的骨骼肌功能恢复。

Wnt7a 在骨骼肌损伤修复中发挥重要作用。Wnt7a 可通过多条非经典Wnt 信号通路，促进肌卫星细胞增殖和迁移，加速骨骼肌损伤修复过程[7]。以Wnt7a 为代表的非经典Wnt 信号通路的激活，可有效促进肌卫星细胞扩增、迁移， 促进骨骼肌损伤修复。Wnt7a 对损伤骨骼肌再生的调控机制是通过Wnt7a 与骨骼肌卫星细胞中的受体FZD7 结合导致细胞极化，并选择性增加对称干细胞扩增，促进骨骼肌卫星细胞的大量增殖[8]。Xu 等[9]通过对肌肉损伤后的大鼠给予rh-Wnt7a，表明rh-Wnt7a 的直接作用是促进骨骼肌中的肌纤维增生。骨骼肌再生期间Wnt7a 过表达可显著促进损伤骨骼肌再生，增加了肌卫星细胞数量；骨骼肌中Wnt7a 缺失时则表现为损伤骨骼肌中肌卫星细胞数量显著降低；这表明Wnt7a 可作为刺激肌肉修复的有效促肌原性因子[10，11]。本实验显示家兔腓肠肌急性钝挫伤后1d、2d 组的Wnt7a mRNA 表达水平无明显变化，第3 天后Wnt7a mRNA 表达显著性升高，并在第7 天时表达最高，随后开始下降。HE 染色显示新生肌管和成纤维细胞在钝挫伤后5～7d 开始显著增多，而Wnt7a 也在第7天时达到最高水平，Wnt7a 表达上调与肌细胞再生的病理过程在时间上有一致性，因此推断这是因为骨骼肌组织在损伤状态下，Wnt7a 参与肌卫星细胞扩增、迁移的结果。有研究发现短时间的Wnt7a 治疗显著刺激了组织的散布和植入，从而显著改善了肌肉功能[12]。用Wnt7a 治疗肌肉损伤可通过增加卫星干细胞的数量以及最终增加整体卫星细胞池来加速肌肉修复。

综上所述，Wnt7a 可能参与骨骼肌损伤的早期修复过程，推测损伤修复的速度很可能与Wnt7a 的表达水平密切相关。本实验只涉及了早期阶段，不能对骨骼肌钝挫伤修复全过程做出定论，Wnt7a 在骨骼肌钝挫伤后修复后期阶段的确切作用还有待进一步研究。