陈慧毅 国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 （北京 100081）

内容提要：诺如病毒导致的儿童和成年人急性胃肠炎经常出现聚集发病，已经成为比较严重的公共卫生事件。近几年诺如病毒核酸检测试剂申报企业数量也在逐年上升，为提高此类产品的质量和方便监管人员的审评尺度，文章介绍了诺如病毒核酸检测试剂的性能要求和研发过程中可能需要关注的问题。

诺如病毒（Norovirus，NV）是导致儿童和成年人急性胃肠炎的主要病原体，临床表现以起病急，传播快，呕吐等为主要特征[1]。诺如病毒感染在冬季呈季节性高发[2]。诺如病毒为单股正链无包膜的RNA病毒，属于杯状病毒科，包括3个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。ORF1编码7种非结构蛋白，参与病毒的复制过程；ORF2编码主要结构蛋白（VP1）；ORF3编码次要结构蛋白（VP2）[3]。诺如病毒分7个基因组（GⅠ-GⅦ）和40多个基因亚型，其中只有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人，我国目前最常见的诺如病毒为GⅠ，GⅡ，其中诺如病毒GⅡ占到86.9%[3,4]。为提高此类产品的质量和方便监管人员的审评尺度，本文介绍了诺如病毒核酸检测试剂的性能要求和研发过程中可能需要关注的问题。

1.预期用途

产品的预期用途决定了产品的定位，明确了产品未来的使用场景，不仅需要说明检测指标的临床意义，更加限定了使用人群。建议申请人在说明书的预期用途部分明确样本类型和检测的基因型别等信息。不同样本类型和基因型别需要在分析性能研究中分别验证。

2.企业参考品、质控品和内对照的设置

企业参考品是考察产品性能的重要工具。一般包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品、精密度参考品等。阳性参考品是评价准确度的重要指标，设置需要覆盖能够检出的基因型别，保证产品不漏检。阴性参考品重点考察产品的特异性，一般需要设置常见的肠道病原体以及容易产生交叉反应的病原体。精密度参考品建议包括产品能够检出的基因型别和不同浓度梯度，其中包括检测限附近的浓度。由于诺如病毒比较容易获取，且人工构建的质粒和真实病毒差异较大，不能完全反映检测试剂的性能，所以企业参考品不建议使用质粒。

试剂盒的质量控制体系一般包括阴阳质控品、内对照等。阴阳质控品应参与样本处理以及核酸的提取环节，等同于样本参与操作的全过程。内对照可对试验过程可能存在的扩增反应抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进行质量控制（内对照既要保证其荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制而导致假阴性）。只有设置全面的质量控制体系才能保证检测过程的完整，有利于检测结果的分析。

3.分析性能

3.1 核酸提取效率的评价

核酸提取主要有以下目的：富集目的基因浓度、保证目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物等，这些都是决定PCR成败的关键环节。因此，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，申请人都应对核酸提取的环节做详细的验证。需要申请人提交核酸提取效率的评价资料，并且在说明书中注明配套使用的核酸提取试剂或核酸提取仪型号，以方便使用者参考。

3.2 准确度评价

可以采用已上市同类产品的方法学比较、检测阴阳性企业参考品等方法。其中阳性样本或阳性企业参考品的检测旨在评价试剂盒检测范围内的各种主要型别是否能被检出。阴性样本或阴性企业参考品旨在评价试剂特异性。

3.3 包容性的评价

由于病毒容易出现变异，不同时间、区域的病毒可能在基因序列存在差异，申报产品能否检测出不同时间、区域的病毒株是能否满足临床检测要求的重要指标。包容性验证中建议使用临床样本，样本浓度建议使用最低检测限浓度附近。

3.4 最低检测限评价

最低检测限能够反映试剂的最低检出能力，是评价试剂性能的重要指标。

3.4.1 最低检测限的建立

建议采用对已知浓度的样本进行系列稀释后重复检测的方法，确定申报试剂的最低检测限。在上述重复检测过程中，记录不同稀释度样本检出的结果。采用适当的模型（如Probit模型）和分析方法，计算试剂在设定概率下的检测限，一般选择检测浓度具有95%的阳性检出率。

建议通过另外制备最低检测限浓度水平的病毒稀释液对95%的检出率进行确认。

3.4.2 最低检测限的验证

申请人应在病毒最低检测限或接近最低检测限的浓度，对每种型别的病毒（病毒株或临床样本）进行验证。

每种病毒型别分别建立和验证最低检测限。

3.5 精密度评价

精密度包括重复性、中间精密度和再现性，一般建议申请人对试剂精密度进行全面评价。申请人进行精密度评价应主要关注以下几点。

首先，需要对影响精密度的主要变量进行验证，包括操作者、时间、地点、测量仪器、测量程序、试剂批次、检测轮次等，精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。

其次，设定合理的评价周期，一般建议进行为期20d检测。

再次，建议使用临床样本或病毒株进行精密度评价，并至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中或强阳性样本。①阴性样本：待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率为100%（n≥20）。②临界阳性样本：待测物浓度略高于最低检测限水平，阳性检出率为100%（n≥20）。③中或强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤10%（n≥20）。

3.6 特异性

3.6.1 交叉反应

用于交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面：近缘微生物、易引起相同或相似临床症状的病原体、感染部位的定植菌等。如：轮状病毒、肠道腺病毒、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌属、志贺菌属、临床常见厌氧菌等。

建议选择高浓度水平的交叉反应物进行验证。通常，细菌感染的水平为106CFU/mL或更高，病毒为105PFU/mL或更高。

申请人应提供所有病原体的详细资料，包括病原体的来源、确认方法、浓度检测方法等。

3.6.2 干扰物质

建议申请人根据所采集的样本类型，针对可能存在的干扰情况进行验证。建议在每种干扰物质的潜在最大浓度进行评价，并在诺如病毒临界阳性水平进行检测。潜在干扰物质的选取应至少包括：血红蛋白、白细胞、黏蛋白、粪便中未消化的食物纤维、临床常用药物干扰等。

4.阳性判断值

阳性判断值确定资料主要指对申报产品核酸检测的Ct值，即结果判断的临界值进行确认的资料。阳性判断值研究资料样本来源应考虑不同年龄、性别、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。建议申请人采用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲线的方式确定申报试剂用于结果判断的临界值。有关ROC曲线分析的细节，请参考国内外相关的文件。如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，应说明这种方法的合理性，提供内对照值的确定方法和研究资料。阈值设置应科学合理。

另外，建议通过临床评价进一步验证和确认阳性判断值的准确性。

5.讨论

诺如病毒通过以粪口途径传播为主，患者的呕吐物、排泄物形成的气溶胶，极易造成环境污染，导致聚集性病例，可能引起重症和死亡，成为严重的公共卫生问题[5,6]。及时的寻找致病病原体和切断传播途径，是防止疾病大面积扩散的有效手段。

本文简单介绍了此类产品上市前的性能要求，包括设定合理的预期用途、制备完善的企业参考品、充分合理的分析性能验证、正确的阳性判断值等。产品的设计开发验证是一个系统工程，前期还需要对原材料进行严谨的筛选验证，制定严格的质量控制标准。同时还需要对产品涉及的各种生产工艺进行研究确认。上市前还需要研究产品的长期稳定性，开封稳定性，运输稳定性等。最后还需要提供临床评价资料证明产品的临床有效性。诺如病毒是一种RNA病毒，随着时间容易发生变异和重组，重组型诺如病毒的RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）区和VP1区差异会导致不同基因亚型[7]。产品设计开发过程中需要重点关注设计的引物探针序列是否在保守区域，能否检出突变株。同时，考虑到我国区域辽阔，建议申请人选择不同时间、区域的样本进行验证，保证临床检测中不漏检。