张雪娇，刘登勇,2,，王惠民

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095；3.中兴大学生物医学工程研究所，中国 台湾 台中 40249）

抗氧化是保持生物体内稳态的积极生理过程[1]，机体在代谢过程中会产生自由基，当自由基过量时将发生氧化应激反应，产生以H2O2、超氧阴离子自由基、羟自由基和一氧化氮形式存在的活性氧（reactive oxygen species，ROS）物质[2]。生物体内多余的ROS会氧化和攻击DNA、脂质、蛋白质等大分子物质[3]，导致衰老[4]和一些疾病（癌症[5]、动脉粥样硬化[6]、中风[7]、阿尔茨海默病[8]、帕金森病[9]和糖尿病[10]等）的发生。

近年来，生物活性肽作为一种天然抗氧化剂来源被人们广泛关注。研究发现，胶原蛋白等肉类加工副产物可成为抗氧化肽来源[11]。León-López[12]和Sarbon[13]等研究表明，胶原蛋白水解物由于具有疏水性氨基酸含量较高、分子质量较低等特点，能够释放电子和稳定自由基，具有较高的抗氧化活性。众所周知，口服生物活性肽多数很难穿透肠黏膜，在体循环中也会被迅速代谢。Liu等[14]研究结果表明，每天摄入胶原蛋白水解物可以改变人体血液中肽的组成比例，并保持较高水平的肽含量，这与胶原蛋白中含有较多的羟脯氨酸有关。羟脯氨酸作为亚氨基酸之一，其在肽序列中可使胶原衍生低聚肽对肽酶或蛋白酶产生高度抗性，口服后经过胃肠消化吸收至血液中仍能以肽的形式存在，这表明可依据羟脯氨酸小肽能够完整通过肠细胞中肽转运体被吸收至血液中的特点，更稳定、高效地发挥肽的生物活性[15-16]。

研究表明，口服猪、鸡、鱼等动物源胶原蛋白水解物后，人体血液中出现多种羟脯氨酸小肽，如Hyp-Gly、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Pro-Hyp、Ser-Hyp、Phe-Hyp、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Glu-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Phe-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly以及一些环肽[17-21]。虽已有部分对胶原蛋白水解物的抗氧化性和血液中胶原蛋白衍生羟脯氨酸小肽的氨基酸序列及含量方面的研究，但胶原蛋白水解物经消化吸收后，血液中存在的羟脯氨酸小肽是否具有抗氧化性尚鲜见报道。因此，本实验采用测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)，ABTS）阳离子自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基清除率4 种方法，评价血液中检测到的15 条胶原蛋白衍生羟脯氨酸小肽的体外抗氧化活性，为胶原蛋白水解物以及相关小肽作为有效功能活性成分应用于功能性食品等领域提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二肽：Hyp-Gly（Hyp-G）、Ala-Hyp（A-Hyp）、Leu-Hyp（L-Hyp）、Ile-Hyp（I-Hyp）、Pro-Hyp（P-Hyp）、Ser-Hyp（S-Hyp）、Phe-Hyp（F-Hyp）、Glu-Hyp（E-Hyp）；三肽：Gly-Pro-Hyp（GP-Hyp）、Glu-Hyp-Gly（E-Hyp-G）、Ser-Hyp-Gly（S-Hyp-G）、Ala-Hyp-Gly（A-Hyp-G）、Pro-Hyp-Gly（P-Hyp-G）、Phe-Hyp-Gly（F-Hyp-G）、Leu-Hyp-Gly（L-Hyp-G）（纯度＞95%）上海强耀生物科技有限公司。

DPPH、ABTS美国Sigma-Aldrich公司；Tris北京索莱宝科技有限公司；焦性没食子酸、过硫酸钾、水杨酸、硫酸亚铁、L-抗坏血酸上海麦克林生化科技有限公司；甲醇（分析纯）天津福晨化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸（分析纯）锦州古塔城化学试剂有限公司；体积分数30%过氧化氢（分析纯）天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

透明孔板96/48 孔美国康宁公司；电子分析天平（万分之一）梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PE Victor X3多功能酶标仪美国PerkinElmer公司；生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；单道移液器（1 mL/200 μL）德国Eppendorf公司；8 道移液器（50 μL/300 μL）北京大龙兴创实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除活性的测定

参考Sharma等[22]方法并略作改动，用甲醇配制DPPH反应溶液（0.065 mmol/L，超声30 min，现配现用）。取96 孔板，每孔中加入50 μL样品溶液和200 μL DPPH反应液，混匀后室温下避光反应30 min，用酶标仪在517 nm波长处测定溶液体系OD值。以蒸馏水代替DPPH反应溶液作为样品对照，蒸馏水代替样品溶液作为空白，抗坏血酸作为阳性对照。DPPH自由基清除率按式（1）计算。每个样品平行3 次，结果取平均值。

式中：OD0为蒸馏水代替DPPH反应溶液体系的OD517nm；OD1为蒸馏水代替样品溶液体系的OD517nm；OD2为样品溶液与DPPH反应液混合体系的OD517nm。

1.3.2 ABTS阳离子自由基清除活性的测定

参考李新[23]的方法并略作改动，用蒸馏水配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，将ABTS溶液和过硫酸钾溶液以体积比1∶1混匀，常温下避光放置12～16 h，形成ABTS阳离子储备液，于4 ℃条件下贮存备用。使用前用无水乙醇对ABTS阳离子储备液进行适当稀释，使稀释后溶液OD734nm为0.70±0.02，得到ABTS阳离子工作液。在96 孔板中每孔加入20 μL样品溶液以及180 μL ABTS阳离子工作液，混匀，在30 ℃下反应10 min，用酶标仪在734 nm波长处测定溶液体系OD值。其中，以蒸馏水代替ABTS阳离子工作液体系作为样品对照，蒸馏水代替样品溶液作为空白，以抗坏血酸作为阳性对照。ABTS阳离子自由基清除率按式（2）计算。每个样品平行3 次，结果取平均值。

式中：OD0为蒸馏水代替ABTS阳离子工作体系的OD734nm；OD1为蒸馏水代替样品溶液体系的OD734nm；OD2为样品溶液与ABTS阳离子工作液混合体系的OD734nm。

1.3.3 羟自由基清除活性的测定

参考张新霞[24]的方法并略作改动。取48 孔板，每孔中加入样品溶液、6 mmol/L硫酸亚铁溶液、6 mmol/L过氧化氢溶液各100 μL，在37 ℃下恒温预热10 min后加入100 μL 6 mmol/L水杨酸乙醇溶液，继续于37 ℃下恒温加热30 min，用酶标仪在510 nm波长处测定溶液体系OD值。其中，蒸馏水代替样品溶液作为空白，蒸馏水代替过氧化氢溶液作为样品对照，以抗坏血酸作为阳性对照。羟自由基清除率按式（3）计算。每个样品平行3 次，结果取平均值。

式中：OD0为蒸馏水代替样品溶液体系的OD510nm；OD1为蒸馏水代替过氧化氢溶液体系的OD510nm；OD2为样品溶液与硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸乙醇溶液混合体系的OD510nm。

1.3.4 超氧阴离子自由基清除活性的测定

参考Zhang Qingan等[25]的方法并略作改动。取48 孔板，每孔中加入450 μL Tris-HCl溶液（50 mmol/L、pH 8.2）预热25 min，然后加入100 μL样品溶液和40 μL 6 mmol/L邻苯三酚溶液，在25 ℃下准确反应4 min后加入50 μL 8 mol/L盐酸溶液终止反应，用酶标仪于320 nm波长处测定溶液体系OD值。以蒸馏水代替样品溶液作为空白，蒸馏水代替邻苯三酚溶液作为样品对照，以抗坏血酸作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率按式（4）计算。每个样品平行3 次，结果取平均值。

式中：OD0为蒸馏水代替样品溶液体系的OD320nm；OD1为蒸馏水代替邻苯三酚溶液体系的OD320nm；OD2为样品溶液与邻苯三酚溶液反应体系的OD320nm。

1.4 数据统计与分析

实验结果均采用平均值±标准差表示。利用Origin 2018软件绘图，Excel 2017软件对数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除活性

图 1 羟脯氨酸二肽对DPPH自由基的清除能力Fig. 1 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide onDPPH radicals

图 2 羟脯氨酸三肽对DPPH自由基的清除能力Fig. 2 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on DPPH radicals

由图1、2可知，15 条羟脯氨酸小肽中，8 条二肽以及7 条三肽均具有一定的DPPH自由基清除活性。8 条二肽中，二肽L-Hyp的DPPH自由基清除活性最强，清除率最高达23.6%；较高浓度时，与其余5 条三肽相比，三肽P-Hyp-G和S-Hyp-G的DPPH自由基清除活性较强，浓度3.0 mmol/L时，清除率分别为16.4%和16.8%。15 条羟脯氨酸小肽的DPPH自由基清除能力均随浓度的增加而增强，但增幅较小，且呈一定的浓度依赖性。15 条羟脯氨酸小肽的DPPH自由基清除率远小于VC阳性对照组，除二肽L-Hyp相对较高外，其余小肽均低于15%。此外，15 条羟脯氨酸小肽的DPPH自由基清除率曲线变化趋势相近，部分曲线几乎重叠，表明羟脯氨酸二肽和三肽表现出相似的DPPH自由基清除能力，但活性均较低。

2.2 ABTS阳离子自由基清除活性

图 3 羟脯氨酸二肽对ABTS阳离子自由基的清除能力Fig. 3 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on ABTS cation radicals

图 4 羟脯氨酸三肽对ABTS阳离子自由基的清除能力Fig. 4 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on ABTS cation radicals

由图3、4可知，15 条羟脯氨酸小肽中二肽L-Hyp、I-Hyp、E-Hyp、Hyp-G、A-Hyp和三肽P-Hyp-G、F-Hyp-G、E-Hyp-G、L-Hyp-G具有ABTS阳离子自由基清除活性，并随着浓度的增加活性增强，其他序列小肽均未检测出ABTS阳离子自由基清除活性。浓度3.0 mmol/L时，二肽L-Hyp和I-Hyp的ABTS阳离子自由基清除率最高，分别为57.8%和57.7%，二肽E-Hyp、Hyp-G、A-Hyp和三肽P-Hyp-G、F-Hyp-G、E-Hyp-G、L-Hyp-G的ABTS阳离子自由基清除率均较低，均小于15%。有研究表明，ABTS阳离子自由基清除活性与抗氧化性之间存在直接联系。20 种氨基酸中半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸具有ABTS阳离子自由基清除活性，说明氨基酸中疏水性氨基酸具有较高的ABTS阳离子自由基清除能力[26]，但过多的疏水性氨基酸存在于肽中会降低肽的溶解度，进而降低肽的ABTS阳离子自由基清除能力[27]。由图3、4可知，亮氨酸和异亮氨酸本身虽不具有ABTS阳离子自由基清除活性，但与羟脯氨酸结合形成二肽后，L-Hyp和I-Hyp的活性均较高，而含有亮氨酸的羟脯氨酸三肽L-Hyp-G活性较低，由此可见，肽的自由基清除活性与氨基酸种类、组成和序列相关，但与肽链长短无关[28]。结果表明，羟脯氨酸小肽中L-Hyp、I-Hyp能够有效清除部分ABTS阳离子自由基，对自由基链式反应有一定的影响。

2.3 羟自由基清除活性

图 5 羟脯氨酸二肽对羟自由基的清除能力Fig. 5 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on hydroxyl radicals

图 6 羟脯氨酸三肽对羟自由基的清除能力Fig. 6 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on hydroxyl radicals

由图5、6可知，15 条羟脯氨酸小肽均具有一定的羟自由基清除能力，并且随浓度的增加而升高。浓度为3.0 mmol/L时，羟脯氨酸二肽的羟自由基清除能力由大到小依次为F-Hyp（50.3%）＞I-Hyp（50.0%）＞S-Hyp（48.3%）＞P-Hyp（46.3%）＞E-Hyp（43.9%）＞L-Hyp（43.0%）＞A-Hyp（41.9%）＞Hyp-G（38.5%）；浓度为3.0 mmol/L时，羟脯氨酸三肽的羟自由基清除能力由大到小依次为F-Hyp-G（47.9%）＞S-Hyp-G（47.8%）＞A-Hyp-G（46.6%）＞GP-Hyp（43.1%）＞L-Hyp-G（42.8%）＞E-Hyp-G（41.3%）＞P-Hyp-G（31.0%）。浓度为3.0 mmol/L时，15 条羟脯氨酸小肽的羟自由基清除率均在30%～50%之间。脯氨酸小肽具有较高的羟自由基清除活性，可能与肽序列中含有疏水性氨基酸有关，因过多的疏水性氨基酸会降低活性肽的溶解度，使小肽具有较高的羟自由基清除活性[27]。而羟自由基是生物体内最活泼、毒性最强的氧族自由基之一，对生物体影响较大，可与生物体内氨基酸、DNA、脂质和蛋白质发生氧化应激反应。羟自由基可使肽键断裂产生羰基，破坏蛋白质一级结构，对细胞造成损伤[3]。以上结果表明，15 条羟脯氨酸小肽均可有效清除羟自由基，对生物体的自由基损伤有一定的保护作用。

2.4 超氧阴离子自由基清除活性

图 7 羟脯氨酸二肽对超氧阴离子自由基的清除能力Fig. 7 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing dipeptide on superoxide anion radicals

图 8 羟脯氨酸三肽对超氧阴离子自由基的清除能力Fig. 8 Scavenging capacity of hydroxyproline-containing tripeptide on superoxide anion radicals

由图7、8可知，15 条羟脯氨酸二肽及三肽均具有较高的超氧阴离子自由基清除能力，并随浓度的增加呈线性升高趋势。浓度3.0 mmol/L时，羟脯氨酸二肽的超氧阴离子自由基清除能力由大到小依次为Hyp-G（83.7%）＞A-Hyp（76.4%）＞L-Hyp（72.7%）＞I-Hyp（72.2%）＞P-Hyp（68.5%）＞S-Hyp（66.2%）＞F-Hyp（64.5%）＞E-Hyp（60.1%）；浓度为3.0 mmol/L时，羟脯氨酸三肽的超氧阴离子自由基清除能力由大到小依次为GP-Hyp（82.2%）＞E-Hyp-G（75.8%）＞S-Hyp-G（73.2%）＞A-Hyp-G（70.5%）＞P-Hyp-G（68.3%）＞F-Hyp-G（67.0%）＞L-Hyp-G（64.7%）；浓度为3.0 mmol/L时，15 条羟脯氨酸小肽的超氧阴离子自由基清除率均在60%～85%之间，其中二肽Hyp-G和三肽GP-Hyp的超氧阴离子自由基清除活性最高，分别为83.7%和2.2%。超氧阴离子自由基是生物体内产生的第1个自由基，在细胞及生物体中具有很强的氧化毒性[3]。以上结果表明，15 条羟脯氨酸小肽在体外抗氧化实验中均表现出可减少超氧阴离子自由基对细胞及生物体损伤的能力。

3 结 论

胶原蛋白物经消化吸收后，在血液中存在的序列为Hyp-Gly、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ile-Hyp、Pro-Hyp、Ser-Hyp、Phe-Hyp、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Glu-Hyp-Gly、Ser-Hyp-Gly、Ala-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Phe-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly。本实验通过测定上述15 条羟脯氨酸小肽的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力，结果表明，15 条羟脯氨酸小肽中部分小肽具有一定的抗氧化能力，但均能很好地淬灭超氧阴离子自由基和羟自由基，其中二肽Leu-Hyp、Ile-Hyp的体外抗氧化活性最好，有成为天然抗氧化剂的潜力。同时，由于羟脯氨酸的酶抗性，及其在食品加工、胃消化和酶解时更稳定、更高效的特点[29]，羟脯氨酸小肽可作为有效的功能活性成分应用于功能性食品等领域。