田东梅，廖海霞，王雪娇,李亨利，尹 欣，朱明辉

(成都中医药大学医学与生命科学学院/附属生殖妇幼医院，四川 成都 610000)

京尼平属环烯醚萜类物质，由传统中药——杜仲等提取的京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解而成，是一种很好的炎症抑制剂[1]。有研究发现，京尼平在抗肿瘤、抗血栓、抗炎和治疗糖尿病等方面均具有显著疗效[2-3]。在生殖内分泌疾病中，多囊卵巢综合征是一种常见疾病，常伴慢性炎症和氧化应激[4-5]。有研究表明，多囊卵巢综合征患者卵巢组织局部存在慢性炎性反应，主要是由于产生了过量的肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6(IL-6)等，并激活核因子κB(NF-κB)，从而引发颗粒细胞过早凋亡，抑制了优势卵泡的形成[6]。如何改善多囊卵巢综合征患者的炎症状态，对其治疗具有积极的意义。本研究利用脂多糖(LPS)模拟了人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞株)的氧化应激状态，探索了京尼平可能的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株来源 KGN细胞株由中国科学院成都生物研究所王飞教授惠赠。

1.1.2试剂与仪器 京尼平为北京索莱宝科技有限公司产品；CCK-8为日本同仁化学研究生产品，雌激素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购自贝斯维斯公司，线粒体解偶联蛋白2(UCP2)、NF-κB抗体购自proteintech，17α羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)抗体购自affinity，辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，杜氏改良Eagle培养基/F12培养基购自美国Gibco公司，电泳仪(型号Power Pac Basic)、酶标仪(型号iMarkTMMicroplate reader)均购自美国Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 KGN细胞株培养采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ/mL链霉素，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。待细胞密度达80%时加入2 μg/mL的LPS建立氧化应激状态，继续培养24 h后加入不同质量浓度的京尼平进行干预。设置空白对照组(添加相应剂量溶剂二甲基亚砜的DMEM/F12培养基)、LPS组和LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组。

1.2.2KGN细胞株活性检测 不同质量浓度(0、0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L)京尼平处理KGN细胞株，干预0、12、24、36、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 mL再孵育1 h；在酶标仪450 nm波长下检测光密度值(OD值)。实验独立重复3次，每次设立5个复孔。

1.2.3细胞培养液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6检测 采用ELISA检测不同质量浓度京尼平干预24 h后细胞培养液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6水平。设置空白孔、空白对照孔、标准品孔及样品孔。空白孔、空白对照孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔加入配好的标准品50 μL，后加入辣根过氧化物酶100 μL；样品孔加入样本50 μL后加入辣根过氧化物酶100 μL，37 ℃温育60 min。每孔加满洗涤液，静置1 min后弃上清液，重复洗涤5次，拍干后每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL终止反应。以空白孔调零，依序测量各孔450 nm波长OD值，计算样品质量浓度。

1.2.4蛋白质印迹(Western blotting)法检测KGN细胞株UCP2、NF-κB、CYP19A1、CYP17A1蛋白表达 采用RIPA 蛋白裂解液提取各组KGN细胞株总蛋白，采用BCA法测定细胞总蛋白浓度。上样量根据测得的蛋白浓度计算，确保每孔上样量相同，进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺120 V电泳，低温转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加对应的一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育1 h，充分洗涤后采用超敏化学发光底物试剂盒进行显影，反应5 min后开始胶片曝光。蛋白表达量用目标蛋白与内参β-actin的OD值比值表示。

2 结 果

2.1不同质量浓度京尼平对KGN细胞株活性的影响 与空白对照组比较，LPS+0.5 mmol/L京尼平组KGN细胞株活性无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株生长受到明显抑制，差异均有统计学意义(P<0.05)；随时间增加，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株生长明显受到抑制，细胞数量越来越少。见图1。

与LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组比较，aP<0.05。

2.2不同质量浓度京尼平对氧化应激状态下雌激素水平，以及IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表达的影响 各组KGN细胞株雌激素水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与LPS组比较，空白对照组KGN细胞株IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表达均明显降低，LPS+0.05、0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株IL-4表达均明显降低，LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株IL-5表达均明显降低，LPS+0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株IL-1β表达明显降低，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平组IL-6表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余各组IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组KGN细胞株CYP17A1、CYP19A1、UCP2、NF-κB蛋白表达比较 与LPS组比较，空白对照组KGN细胞株UCP2、NF-κB蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株UCP2蛋白表达均略有下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组KGN细胞株NF-κB蛋白表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；LPS+0.05 mmol/L京尼平组细胞株NF-κB蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平组间KGN细胞株NF-κB蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。各组KGN细胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

氧化应激作为机体氧化还原反应失衡的直接表现，活性氧浓度升高，超出内源性抗氧化系统的清除能力，最终导致细胞氧化损伤。氧化应激参与精卵和胚胎的重要生理活动，当其浓度失控时会损害精子、卵子和胚胎质量，使受孕失败[7]。因此，最大限度地避免产生过量活性氧至关重要。临床对改善女性生殖系统氧化应激的药物较少，作用机制尚不明确。有研究发现，京尼平在抗炎和治疗糖尿病等方面疗效显著[2-3]。而京尼平在生殖系统方面的研究较少。本研究从分子水平了解了在LPS诱导KGN细胞株氧化应激状态下京尼平的抗炎作用。

3.1京尼平对常规条件下培养的KGN细胞株活力的影响 本研究结果显示，京尼平质量浓度为0.05 mmol/L时对细胞活性无明显影响，京尼平质量浓度大于或等于0.10 mmol/L时KGN细胞株出现明显抑制，且随质量浓度增加抑制作用更明显，京尼平质量浓度大于或等于0.20 mmol/L时KGN细胞数量出现肉眼可见的减少，说明京尼平质量浓度过高时对细胞具有致死性。目前，已有研究发现，京尼平质量浓度过高会促进细胞凋亡，而适当质量浓度京尼平可缓解细胞的氧化应激而提高其存活率[8-11]。

3.2京尼平对氧化应激状态下KGN细胞株分泌功能的影响 有研究发现，京尼平质量浓度为50 mmol/L时能显著提高3β-羟基类固醇脱氢酶、CYP17A1、17β羟化类固醇脱氢酶表达水平，从而促进睾酮和雌二醇合成[12]。本研究结果显示，各组KGN细胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；各组上清液中雌激素水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，提示炎性状态未影响细胞雌激素分泌，但尚需进一步研究证实。

3.3京尼平对氧化应激状态下KGN细胞株的抗炎作用 UCP2在线粒体电子传递链的能量代谢中发挥着重要作用，与抗氧化应激系统密切相关[13]。有研究发现，UCP2在人卵丘细胞中表达，可能参与卵泡发育和卵母细胞成熟和质量调控[14]。本研究结果显示，添加LPS后UCP2、NF-κB蛋白，以及IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表达均明显增加。炎症指标的明显增加提示氧化应激模型的成功建立。不同质量浓度京尼平干预后IL-4、IL-5表达均明显降低，高质量浓度京尼平干预后IL-6、IL-1β表达均明显降低，NF-κB蛋白表达也下降，提示京尼平具有抗炎作用，但不同质量浓度京尼平干预后UCP2蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。可能由于京尼平不通过调节UCP2蛋白的表达而发挥抗炎作用。已有的研究表明，京尼平能有效抑制LPS引起的KGN细胞株诱导型一氧化氮合酶等炎症因子的表达[15]，与本研究结果一致，提示京尼平具有抗炎作用。另有研究发现，京尼平可通过阻断NF-κB减轻LPS诱导的炎性反应，从而缓解急性肺损伤[16]。本研究在KGN细胞株中同样发现京尼平可通过阻断NF-κB蛋白表达而减轻LPS诱导的炎性反应。

综上所述，京尼平可缓解LPS诱导的KGN细胞株氧化应激状态，可能通过调节NF-κB蛋白表达而发挥抗炎作用，降低IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β水平。京尼平在氧化应激状态下对雌激素分泌无明显影响，但尚需进一步研究证实。