贾 莉，张 弓

(1.延安市人民医院呼吸科，陕西 延安 716000；2.延安大学附属医院临床药物科，陕西 延安 716000）

茶藨子是虎耳草科茶藨属灌木植物,全世界约有160 多个种［1］,茶藨子是浆果资源,被称为第3代新型果树,具有很高的营养价值,其果实富含维生素、糖类和不饱和脂肪酸等,具有良好的抗氧化活性,被广泛用于食品加工行业(果酱、饮料、酿酒和糖果等)［2］,此外,茶藨子果实还具有治疗感冒、月经不调、降血脂、关节炎、肾炎等多种药理活性［3］；其芽、花和嫩叶可用沸水冲泡代茶用,具有清热、润肝、利尿等功效［4］；民间常将其根泡酒作为药酒,用于治疗风湿病［5］。

目前研究表明茶藨子含有黄酮类［4-6］、β-咔啉生物碱类［7］、萜类［8］、多酚类［9］和甾体类［4,10］等成分。其中,黄酮和生物碱类被认为是茶藨子产生多种药理活性的主要功能性成分［11］。五裂茶藨子Ribes meyeriMaxim.是众多茶藨子中的一种,主要分布于青海、四川、甘肃、新疆等地区。其性甘、微寒,具有滋补、止泻、敛毒、除黄水之功效。李静等［12］对五裂茶藨子叶的化学成分进行研究,从中分离纯化出8 个单体化合物,其中6 个黄酮、2个其他化合物,并对所得化合物的抗炎活性进行了测试。该药材在我国西部地区一直被广泛使用,但是有关其物质基础研究严重不足。本实验拟通过现代色谱系统(中压制备色谱系统和DAC-50 系统)结合核磁波谱解析的方法对五裂茶藨子叶的化学成分进行分离纯化和结构鉴定,以期为其进一步开发应用提供理论依据。

1 材料

R-1020 旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；TY-20 L 中药超微粉碎机(济南天宇专用设备有限公司)；HZ-TQG 提取浓缩机组(上海辉展实验设备有限公司)；大孔树脂中压柱色谱体系、反相C18DAC-50 制备色谱体系(江苏汉邦科技有限公司)；硅胶常压柱色谱(青岛海洋化工有限公司)；分析纯乙醇、石油醚、乙酸乙酯和制备级甲醇(南京化学试剂有限公司)。药材于2017 年购买于青海省康乐药材市场,经中国科学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定为正品。

2 提取与分离

取10 kg 五裂茶藨子叶,粉碎,过筛后平均分为5 份分别用纱布包裹,放入提取浓缩机组中80%乙醇提取,料液比1 ∶8,提取温度70 ℃,提取时间3 h,共提取3 次。所得提取液进行浓缩至药液浓度足够大但无沉淀析出。将浓缩液上样于中压大孔树脂柱色谱中,首先以水进行充分洗脱去除蛋白和多糖类等物质。然后分别用30%、60%、90%乙醇分别进行梯度洗脱,每一梯度所用溶液体积为4倍柱体积。将60%乙醇洗脱组分浓缩至药液浓度足够大且无沉淀析出后上样于常压硅胶柱色谱,用石油醚-乙酸乙酯(20 ∶1～15 ∶1～10 ∶1～5 ∶1～1 ∶1) 梯度洗脱,每一梯度所用洗脱液体积为3倍柱体积,5 个组分分别为Fr.1～Fr.5,对所得5个组分通过旋转蒸发仪进行减压浓缩,浓缩至药液浓度足够大然后作为DAC-50 的制备样品。反相DAC-50 制备液相系统采用甲醇-水作为洗脱溶剂,Fr.1 组分经65%甲醇-水洗脱,分离纯化得化合物1 (8 mg)、4 (13 mg)、5 (10 mg)、6 (21 mg)；Fr.2 组分经55% 甲醇-水洗脱,纯化得化合物10(7 mg)、14 (11 mg)、15 (14 mg)。Fr.3 经45%甲醇-水洗脱,分离纯化得化合物12 (22 mg)、13(15 mg)；Fr.4 组分经35% 甲醇-水洗脱,分离纯化得化合物2 (9 mg)、3 (16 mg)、9 (19 mg)、11 (13 mg)；Fr.5 组分经25%甲醇-水洗脱,分离纯化得化合物7 (12 mg)、8 (14 mg)。

3 结构鉴定

化合物1:黄色粉末。ESI-MSm/z:333.1［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:3.83(6H,s,C3′,C5′-OCH3),6.18 (1H,d,J=1.2 Hz,H-6),6.54 (1H,d,J=1.2 Hz,H-8),6.91(1H,s,H-3),7.34 (1H,m,H-2′,6′),9.27(1H,s,4-OH),10.67 (1H,s,7-OH),12.98(1H,s,5-OH)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:181.9 (C-4),164.2 (C-2),164.2 (C-4′),163.8 (C-7),161.5 (C-9),157.5 (C-5),148.5(C-3′,5′),139.8 (C-1′),120.6 (C-10),104.6(C-2′,6′),103.8 (C-3),98.9 (C-6),94.3 (C-8),56.5 (C3′,C5′-OCH3)。以上数据与文献［12］ 报道基本一致,故鉴定为小麦黄素。

化合物2:黄色粉末。ESI-MSm/z:493.1［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:12.93(1H,s,5-OH),9.38 (1H,s,4′-OH),7.31 (2H,s,H-2,6),6.82 (1H,d,J=1.9 Hz,H-8),6.41(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.93 (1H,d,J=1.9 Hz,H-3),3.64 (6H,s),5.26 (1H,s),3.32(1H,m),3.30 (1H,m),3.02 (1H,m),3.66(1H,m),3.52 (1H,d),3.31 (1H,m)；13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:183.5 (C-4),165.6 (C-2),164.4 (C-7),162.5 (C-5),158.3 (C-9),149.7 (C-3′,5′),141.5 (C-4′),121.7 (C-1′),106.8 (C-10),105.9 (C-2′,6′),105.5 (C-3),99.8 (C-6),96.7 (C-8),101.5 (C-1″),78.7 (C-5″),74.6 (C-2″),77.8 (C-3″),68.9 (C-4″),61.9 (C-6″)。以上数据与文献［13］ 报道基本一致,故鉴定为小麦黄素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖。

化合物3:黄色粉末。ESI-MSm/z:431.2［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:7.64(d,2H,J=8.7 Hz,H-2′,6′),6.87 (d,2H,J=8.7 Hz,H-3′,5′),6.43 (d,1H,J=1.6 Hz,H-8),6.23 (d,1H,J=1.6 Hz,H-6),5.25 (d,1H,J=1.3 Hz,Rha-H-1),0.77 (d,3H,J=5.7 Hz,Rha-H-6)；13C-NMR (150 MHz,DMSOd6)δ:176.6 (C-4),163.4 (C-7),160.2 (C-5),158.9 (C-4′),156.1 (C-2),155.5 (C-9),133.1(C-3),129.5 (C-2′,6′),121.5 (C-1′),116.4(C-3′,5′),105.0 (C-10),99.7 (C-6),94.7 (C-8),102.8 (Rha-C-1),71.6 (Rha-C-2),71.3(Rha-C-3),72.1 (Rha-C-4),71.0 (Rha-C-5),17.8 (Rha-C-6)。以上数据与文献［14］ 报道基本一致,故鉴定为山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖。

化合物4:黄色针晶。ESI-MSm/z:331.0［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:12.42(1H,s,5-OH),7.84 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.82 (1H,dd,J=2.0,8.5 Hz,H-6′),6.83 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.86 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.43 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.75 (3H,s,3′-OCH3),3.76 (3H,s,7-OCH3)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:148.1 (C-2),135.1 (C-3),177.1 (C-4),161.4 (C-5),96.4 (C-6),164.9(C-7),91.5 (C-8),155.7 (C-9),104.4 (C-10),122.0 (C-1′),112.6 (C-2′),146.4 (C-3′),148.0 (C-4′),114.6 (C-5′),123.0 (C-6′),55.8(-OCH3),55.4 (-OCH3)。以上数据与文献［15］报道基本一致,故鉴定为甲基鼠李素。

化合物5:黄色粉末。ESI-MSm/z:285.1［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:8.19(2H,d,J=8.7 Hz,H-2′ and H-4′),6.87 (2H,d,J=8.7 Hz,H-3′ and H-5′),6.42 (1H,d,J=1.3 Hz,H-8),6.21 (1H,d,J=1.6 Hz,H-6)；13CNMR (150 MHz,CD3OD)δ:176.9 (C-4),165.2(C-7),162.1 (C-5),158.1 (C-4′),155.8 (C-9),145.6 (C-2),134.7 (C-3),128.3 (C-2′ and C-6′),121.3 (C-1′),113.9 (C-3′ and C-5′),102.1(C-10),96.9 (C-6),94.1 (C-8)。以上数据与文献［16］ 报道基本一致,故鉴定为山柰酚。

化合物6:黄色针晶。ESI-MSm/z:303.5 ［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.64 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),7.54 (1H,dd,J=8.5,1.9 Hz,H-6′),6.79 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.29(1H,d,J=1.5 Hz,H-8),6.09 (1H,d,J=1.7 Hz,H-6)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:174.9(C-4),163.1 (C-7),160.1 (C-5),155.8 (C-9),146.3 (C-2),145.5 (C-4′),143.8 (C-3′),134.8(C-3),121.7 (C-1′),120.3 (C-6′),113.8 (C-5′),113.6 (C-2′),102.1 (C-10),96.8 (C-6),92.0 (C-8)。以上数据与文献［17］ 报道基本一致,故鉴定为槲皮素。

化合物7:白色晶体。ESI-MSm/z:435.3［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:6.86(1H,s,H-2′),6.74 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6′),6.69 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),5.82 (1H,s,H-6),5.88 (1H,s,H-8),5.13 (1H,d,J=10.6 Hz,H-2),4.78 (1H,d,J=10.6 Hz,H-3),3.90～3.32 (6H,m,Ara-H)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:193.6 (C-4),166.9 (C-7),163.6 (C-5),161.8 (C-9),145.6 (C-4′),144.9 (C-3′),126.9 (C-1′),118.8 (C-6′),113.9 (C-5′),113.8(C-2′),100.6 (C-10),98.8 (C-1″),95.7 (C-6),94.9 (C-8),81.8 (C-2),73.9 (C-3),71.4 (C-2″),68.9 (C-4″),64.8 (C-3″),60.9 (C-5″)。以上数据与文献 ［18］ 报道基本一致,故鉴定为(2R,3R) -二氢槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖。

化合物8:白色非晶粉末。ESI-MSm/z:463.2［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.75(1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),7.52 (1H,dd,J=8.5,1.8 Hz,H-6′),6.79 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.40 (1H,s,H-8),6.21 (1H,d,J=1.3 Hz,H-6),5.22 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),3.87～3.51(6H,m,Gal-H)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:177.8 (C-4),163.9 (C-7),160.9 (C-5),156.8(C-2),156.7 (C-9),147.8 (C-4′),143.9 (C-3′),133.8 (C-3),120.9 (C-1′),120.9 (C-6′),115.8 (C-5′),113.9 (C-2′),103.8 (C-10),102.8 (C-1′),97.7 (C-6),92.7 (C-8),74.9 (C-5″),72.8 (C-3″),70.9 (C-2″),67.8 (C-4″),60.6 (C-6″)。以上数据与文献［19］ 报道基本一致,故鉴定为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖。

化合物9:黄色粉末。ESI-MSm/z:499.2［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.89(1H,d,J=1.9 Hz,H-2′),7.67 (1H,dd,J=8.4,1.9 Hz,H-6′),6.92 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.32 (1H,s,H-6),5.19 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),3.91 (1H,d,J=3.7 Hz,H-2″),3.79 (1H,d,J=8.0 Hz,H-3″),3.68 (1H,dd,J=11.2,6.1 Hz,H-4″),3.58-3.49 (2H,m,H-6α″ and H-6β″),3.51 (1H,t,J=6.2 Hz,H-5′)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:178.8 (C-4),157.5 (C-2),153.75 (C-7),153.6 (C-5),148.8 (C-4′),145.5(C-9),144.7 (C-3′),134.8 (C-3),124.9 (C-8),121.54 (C-1′),121.2 (C-6′),116.7 (C-5′),114.7 (C-2′),104.5 (C-10),103.5 (C-1″),75.4(C-5″),73.6 (C-3″),71.5 (C-2″),68.2 (C-4″),60.1 (C-6″)。以上数据与文献［20］ 报道基本一致,故鉴定为棉花素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷。

化合物10:黄色粉末。ESI-MSm/z:465.1［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.65(1H,s,H-2′),7.75 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),6.96 (1H,d,J=7.9 Hz,H-6′),6.45 (1H,s,H-8),6.32 (1H,s,H-6),5.33 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),3.82-3.42 (6H,m,Glu-H)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:178.4 (C-4),164.9 (C-7),161.7 (C-5),157.6 (C-9),157.2 (C-2),148.54(C-4′),144.6 (C-3′),134.2 (C-3),121.8 (C-6′),121.7 (C-1′),116.3 (C-5′),114.6 (C-2′),104.3 (C-10),102.9 (C-1″),98.6 (C-6′),93.4(C-8),77.3 (C-3),76.8 (C-5),74.4 (C-2),69.9 (C-4),61.4 (C-6)。以上数据与文献［21］报道基本一致,故鉴定为异槲皮素。

化合物11:黄色粉末。ESI-MSm/z:435.3［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.81(1H,s,H-2′),7.62 (1H,d,J=5.7 Hz,H-6′),6.93 (1H,s,H-5′),6.45 (1H,s,H-8),6.23(1H,s,H-6),5.21 (1H,d,J=6.0 Hz,H-1″),3.87～3.42 (6H,m,Ara-H)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:177.8 (C-4),165.1 (C-7),162.1 (C-5),156.9 (C-9),157.1 (C-2),147.9 (C-4′),143.9 (C-3′),133.8 (C-3),120.9 (C-6′),120.9(C-1′),115.8 (C-5′),115.1 (C-2′),103.9 (C-1′),102.8 (C-10),97.9 (C-6),92.8 (C-8),71.9 (C-3″),70.9 (C-2″),68.1 (C-4″),66.0 (C-5″)。以上数据与文献［22］ 报道基本一致,故鉴定为槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物12:黄色粉末。ESI-MSm/z:451.3［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.76(1H,s,H-2′),7.65 (1H,s,H-6′),6.47 (1H,s,H-8),6.26 (1H,s,H-6),4.92 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),4.11～3.97 (1H,m,H-5″α),3.62(1H,s,H-4″),3.61 (1H,d,J=7.8 Hz,H-2″),3.52 (1H,d,J=8.9 Hz,H-3″),3.42 (1H,d,J=10.9 Hz,H-5″β)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:176.1 (C-4),163.9 (C-7),160.9 (C-5),157.1(C-9),146.1 (C-2),146.1 (C-3′),146.1 (C-5′),137.2 (C-4′),136.1 (C-3),122.1 (C-1′),109.9 (C-6′),109.0 (C-2′),102.8 (C-1″),103.7(C-10),98.1 (C-6),93.1 (C-8),75.9 (C-3″),72.9 (C-2″),68.9 (C-4″),66.0 (C-5″)。以上数据与文献［23］ 报道基本一致,故鉴定为杨梅素-3′-O-β-D-木糖苷。

化合物13:黄色粉末。ESI-MSm/z:584.3［M-H］-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.83(1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),7.63 (2H,d,J=8.6 Hz,H-2‴and H-6‴),7.62 (1H,dd,J=8.4,1.8 Hz,H-6′),6.91 (1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),6.72(2H,d,J=8.6 Hz,H-3‴and H-5‴),6.43 (1H,d,J=1.5 Hz,H-8),6.25 (1H,d,J=1.6 Hz,H-6),5.27 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),4.41 (1H,dd,J=11.3,8.2 Hz,H-6″α),4.43 (1H,dd,J=11.3,4.5 Hz,H-6″β),3.93 (3H,ddd,J=12.5,10.7,4.1 Hz,H-2″,H-3″ and H-5″),3.71 (1H,dd,J=9.5,3.4 Hz,H-4″)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:177.9 (C-4),165.8 (C-7‴),165.1(C-7),161.8 (C-4‴),161.1 (C-5),156.9 (C-2),157.1 (C-9),147.8 (C-4′),145.1 (C-3′),133.8 (C-3),130.9 (C-2‴and C-6‴),120.9 (C-6′),120.9 (C-1′),120.9 (C-1‴),115.9 (C-2′),115.1 (C-5′),115.1 (C-3‴and C-5‴),103.9 (C-10),103.9 (C-1″),99.0 (C-6),92.3 (C-8),72.9 (C-3″/C-5″),72.9 (C-5″/C-3″),72.0 (C-2″),69.0 (C-4″),63.0 (C-6″)。以上数据与文献［24］ 报道基本一致,故鉴定为异槲皮素-6″-O-p-对羟基苯甲酸丁酯。

化合物14:淡黄色粉末。ESI-MSm/z:213.1［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ:8.25(1H,d,J=5.4 Hz,H-4),8.21 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.95 (1H,d,J=5.4 Hz,H-3),7.71(1H,dd,J=8.2,0.9 Hz,H-8),7.62 (1H,ddd,J=8.2,8.0,0.9 Hz,H-7),7.31 (1H,t,J=8.0 Hz,H-6),5.39 (1H,q,J=6.6 Hz,H-1′),1.68(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-2′)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ:143.5 (C-13),138.6 (C-4),137.5(C-10),136.9 (C-1),133.3 (C-11),130.3 (C-7),122.7 (C-5),121.7 (C-12),121.6 (C-6),120.1 (C-3),113.5 (C-8),70.5 (C-1′),19.4(C-2′)。以上数据与文献 ［25］ 报道基本一致,故鉴定为cordysinin C。

化合物15:黄色粉末。ESI-MSm/z:213.1［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ:11.21(1H,s,H-9),8.53 (1H,d,J=5.4,H-3),8.55(1H,d,J=5.4,H-4),8.42 (1H,d,J=8.1,H-5),7.93 (1H,d,J=8.1,H-8),7.72 (1H,d,J=8.1,H-7),7.42 (1H,d,J=8.1,H-6)；13CNMR (150 MHz,DMSO-d6)δ:142.9 (C-1),135.6(C-3),118.5 (C-4),122.3 (C-5),129.5 (C-6),120.3 (C-7),113.3 (C-8),131.9 (C-10),119.9(C-11),131.6 (C-12),135.6 (C-13),165.9 (1-COOH)。以上数据与文献［26］ 报道基本一致,故鉴定为β-carboline-1-carboxylic acid。

4 讨论

研究表明茶藨子叶的主要活性成分为黄酮类,杜伟伟、邹维娜［11,27］分别对茶藨属不同种茶藨子活性成分和药效做了总结,并以香茶藨子叶为研究对象,针对其黄酮类化学成分建立了相应的富集分离工艺,并验证黄酮的药理活性。本实验对五裂茶藨子中黄酮类成分进行探究,结果表明五裂茶藨子的黄酮类化学成分既与茶藨属的其他种的化学成分有相似之处,又有其化学成分的独特性。