任李俊，韩帅琪，胡建宏

(1.白水县同羊原种场，陕西 白水715600；2.西北农林科技大学)

随着我国社会经济的不断向前发展、人民的生活质量也在逐步提升，这使得人们对于优质肉、奶、蛋产品的需求也越来越高。市场的巨大需求也促使我国畜牧业的生产方式以及产业结构发生重大变化，由传统的小规模、散养户养殖方式逐渐向集约化、规模化的现代舍饲饲养转变。同时，伴随着规模化、现代化养殖方式的推广，人工授精技术也开始在畜牧生产中扮演一个越来越重要的角色。相比与常温或低温保存下的精液，冷冻保存的精液保存的时间更长，使得优良种公畜精液的长距离的运输成为可能，扩大了优质精液的使用范围，提高了优秀雄性遗传资源的利用率，并且加快了良种后代育种和扩繁的速度。因此，家畜精液的冷冻保存技术的研究对于畜牧业的发展具有十分重要的意义。

哺乳动物的细胞膜富含多不饱和脂肪酸，其极易遭受细胞内活性氧(ROS)的攻击从而发生脂质过氧化反应。在精液冷冻保存时，精子不断进行能量代谢产生ROS。死亡和损伤的精子则可以产生更多ROS。精液中存在的低含量ROS能够作为一种信号传递物质，调节精子正常生理生化水平。然而当浓度超过一定范围时，ROS会首先作用于精子质膜上的磷脂，对精子质膜造成过氧化损伤，从而破坏精子的正常生理功能；ROS 还可以对精子细胞核中的DNA 结构造成破坏，使得精子发生凋亡；此外，ROS 可降低精子质膜和胞内酶的活性或者造成酶失活，使ROS大量聚集导致一种不良循环，使精子氧化损伤而死亡。目前，常通过在稀释液中添加抗氧化剂来达到防止精子质膜发生脂质过氧化反应，减缓精子细胞的氧化损伤的目的，以期得到最佳的保存效果。

1 酶类抗氧化剂

目前，实际生产中常使用过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-Px)等作为精液冷冻稀释液中的酶类抗氧化剂。精液中添加高活性及高含量的SOD、CAT、GSH和GSH-Px可以显著提高冷冻保存的精液的品质。Leao等研究表明，尽管CAT对稀释或冷冻-解冻后的精液的任一评估参数都不产生影响，但仍能发现在精液冷冻稀释液中加入50 μg/mL CAT有利于维持冷冻保存中精液的质膜完整性，完整率可达62.35%。Olfati等则通过研究向牛精液冷冻稀释剂中添加不同浓度GSH×SOD组合对解冻后荷斯坦牛和西门塔尔牛精液品质的影响，发现荷斯坦牛精液中MDA水平降低而GPx活性增加，西门塔尔牛精液中SOD活性升高，这表明精液稀释液中添加抗氧化剂组合(GSH × SOD)能够提升冻融后精液的品质，这可能与脂质过氧化被抑制以及抗氧化酶活性得到提升有关。Silva等研究表明，稀释液中添加100 U/mL SOD以及2 mM和5 mM GSH均能够保持公羊精子在冻融后的顶体的完整，而向Tris卵黄稀释之中添加100 U/mLSOD则能够维持解冻后的精子细胞膜的完整性。

2 维生素类抗氧化剂

氧化应激和冷休克是精子细胞在进行冷冻保存的过程中最容易受到的两大危害，都会导致精子冻融后出现活力降低的现象。维生素E(VE)是生物体内重要的抗氧化物质，能够抑制氧化自由基的形成，阻止精子细胞脂质层过氧化反应的发生。同时，还具有卵黄的功能，防止冷休克的发生，特别是与环糊精配合使用时，可以调节精子在冻融过程中的氧化应激，提高精子活率。Khellouf等研究表明，在牛精液低温保存的过程中，可以通过预先向胆固醇和VE中加入环糊精来作为一种强效保护剂，以降低冷休克和氧化应激的发生，最终达到提高冻融后精子的运动能力和质膜完整性的目的。而Hu等研究发现，相比于其他浓度，在稀释液中加入1.0和1.5 mg/mL VE时，精液品质的评估参数如VSL和STR值等会显著提高，而且当精液样品添加1.5 mg/mL VE时其中的GSH-Px可达最高，使得顶体与质膜完整率得到明显的提升，从而降低了发生脂质过氧化的可能性，改善了冻融后的精子活力和生存能力。Zhao等研究发现，VC和VE的组合也可以提高精液内的抗氧化酶活性，其中对于精子品质保护效果最好的组合是添加1400 IU/mL的VC以及0.12 IU/mL的VE。此外Varo-Ghiuru等通过研究发现，解冻后精子的活力在浓度为10 μM的叶黄素、200 μM的奎诺二甲基丙烯酸酯、200 μM的VC以及浓度范围为400～200 μM的Trolox和抗坏血酸的作用下能够更强，并且10 μM叶黄素可提高冻融后的NAR和HOST值。

3 植物提取物抗氧化剂

新近研究发现，某些植物中提取的活性物质例如海带多糖、海藻糖、白藜芦醇等也具有抗氧化，清除氧自由基的能力，可以作为一种常用的抗氧化物质使用到精液冷冻保存的过程中以减缓或消除氧化对精子的损伤。提取与多种植物的皮、壳、籽、核、花中的原花青素是一类生物类黄酮，也是一种的天然抗氧化剂，具有极强的抗氧化、清除自由基和活性氧的能力。Li等发现，BTS稀释液中的精液随着寡聚原花青素的加入其MDA和ROS含量在降低，而总抗氧化能力(T-AOC)得到了显著提高，精液质量也随之提升。Zhu等通过研究柠檬酸-葡萄糖稀释液中添加不同浓度海藻糖的对兔精液的影响，发现添加100 mM海藻糖时效果最好。解冻后的兔子精子活力、顶体完整性、膜完整性等得到了明显的改善，而ROS水平和MDA含量也显著降低。Bucak等则发现，与对照组相比，在稀释剂中添加50 mM海藻糖、25 mM牛磺酸、5.0和10 mM半胱胺能够使冻融后精子的活率得到明显改善；维生素E的水平也得到明显提高。另外，Akhtarshenas等还发现当稀释液中添加10 μM抗蛋白酶和30和60 mM海藻糖时，二者能够产生协同作用，显著提高了精液冷冻保存效果。

4 二甲双胍的氧化作用

二甲双胍(metformin)是一类天然的胍类衍生物，来源于法国紫丁香(French Lilac即山羊豆(Galega officinalis Linn)。早在中世纪时期，欧洲就有了使用山羊豆的地上部分来缓解糖尿病患者多尿症状的先例，同时畜牧业中也使用其来进行生物催乳。20世纪20年代，Tanret与Muller从山羊豆种子中提取出山羊豆碱并进行了初步研究，表明山羊豆碱有着降血糖的效果。20世纪20年代至50年代期间，许多的胍类衍生物被先后开发出来，包括十烷双胍和十二烷双胍等，但此类物质的毒副作用一直是一个无法消除的问题。1922年，二甲双胍被爱尔兰化学家Werner和Bell首先制备得到。数年后，人们经动物实验验证了其无毒无害。与此同时胰岛素被发现及广泛使用，这使得双胍类制剂的应用研究也就停止不前。1957年，随着二甲双胍首次在临床上使用，双胍类制剂再次重回人们的视野。不久，苯乙双胍和丁双胍被发现并被允许作为一种治疗糖尿病的药物使用。由于苯乙双胍被发现毒副作用且致死率很高、丁双胍治疗效果较差，随后两者又相继被停用。此后二甲双胍被人们日益重视并广泛使用至今现在。

二甲双胍在抗氧化领域具有良好的效果。Michael等发现可以通过向冷冻稀释液中添加50 μM二甲双胍的方式来提升小鼠精子的抗氧化性，提高其受精能力。Nguyen等的研究结果显示在鸡精液冷冻稀释视液中添加1 mM二甲双胍可以显著提高精子冻融后的品质，并且精子活力可达58.8%。Grandhaye等则研究发现,二甲双胍还能够通过影响线粒体功能的方式来抑制精子的氧化应激反应，进而提升解冻后犬精液的品质。