宋晓蕾，周芬芬，胥 腾，王 莉，李静文，黄海辉

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是革兰阳性专性厌氧梭状芽孢杆菌，是医院获得性腹泻最主要的病原菌，其中25%～33%抗生素相关性腹泻和90%假膜性肠炎由艰难梭菌感染所致[1-2]。艰难梭菌主要通过产生毒素A和毒素B致病，部分菌株如核酸型027和078还可产生二元毒素[3-4]。毒素A和毒素B分别由tcdA和tcdB基因编码，二者位于一个长约19.6 kb的致病决定区（pathogenicity locus）上。该致病决定区除了tcdA和tcdB基因以外，还携带tcdE、tcdR和tcdC基因[4-5]，后者被认为与毒素的表达调控相关。

DNA结合蛋白Spo0A是细胞从营养生长期进入芽孢形成时期的关键应答调节蛋白。同时，Spo0A还控制着细菌的许多其他重要活动，例如对肉毒杆菌神经毒素的产生具有正向调控作用[6]。但是Spo0A对艰难梭菌毒素调控作用的研究较少，且结果不尽相同。因此，本研究构建了艰难梭菌spo0A基因突变株，通过比较突变株与亲代株间致病决定区上相关基因转录差异以及毒素A、毒素B表达差异，探索Spo0A对艰难梭菌毒素调控作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 构建艰难梭菌spo0A 突变株

选取艰难梭菌临床分离株C25用于spo0A基因敲除，该菌株为核糖体014型，产毒素A和毒素B。以标准菌株VPI 10463为对照株。采用ClosTron基因敲除技术在艰难梭菌spo0A基因中插入包含Ⅱ类内含子的序列，使该基因发生突变而失活[7]。

1.2 检测tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE基因表达水平

在不同生长时期，即分别于5 h（指数生长期）、12 h（开始进入平台生长期）、24 h（平台生长期）、48 h时（平台生长末期）分别取（20 mL、10 mL、10 mL、10 mL）菌液离心浓缩后，按说明书裂解细菌、提取RNA、去除基因组DNA，合成cDNA，进行实时定量反转录PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）。……