董旭，韩学昌，邢群智，任岩岩，张亚杰

（河南科技大学临床学院 河南科技大学第一附属医院麻醉科，河南 洛阳471003）

七氟醚是一种气味芬芳的新型吸入麻醉剂,对人体气道造成的刺激较小,具有麻醉诱导和苏醒迅速、对呼吸系统以及心血管系统影响较小等诸多优点,现已在临床上广泛应用于小儿麻醉[1]。临床上需要多次手术的患儿逐渐增加,而七氟醚是目前临床上应用于小儿麻醉的首选药物之一[2]。有研究报道,七氟醚可导致接受过七氟醚麻醉的儿童出现学习记忆的障碍[3]。本文通过研究重复吸入七氟醚大鼠并于正常大鼠进行比较,探究七氟醚对大鼠学习记忆能力的影响,为临床上患儿重复吸入七氟醚进行麻醉的安全性以及可靠性提供理论依据。现报告如下。

1 实验动物与方法

1.1 实验动物

选取由河南科技大学提供的新生SD大鼠48只,均为雄性,SPF级(大鼠合格证编号:SYXK(豫)2018-0015),日龄7d,喂养于光照12h、室内温度23℃～25℃、相对湿度45%～60%、自由进食进水的环境中。

1.2 方法

1.2.1 实验仪器、药品 七氟醚购自山东鲁南贝特制药有限公司(批号65130702),Anti-Tau antibody购自英国Abcam公司(批号:ab32057),Anti-Tau(phosphor Ser396)antibody购自英国Abcam公司

(批号:ab109390),病理切片机购自德国Leica公司,显微镜购自日本OLYMPUS公司,七氟醚挥发罐、S/5多功能麻醉气体监测仪购自美国Datex.Ohmeda公司,WMT-100型Morris水迷宫测试仪购自成都泰盟多功科技有限公司,BDNF抗体购自英国Santa公司,PSD95抗体购自英国Bioss公司,Tau抗体购于英国Bioss公司,荧光二抗购自美国Li-COR公司,ApoE ELISA试剂盒购于美国MyBioSource公司。

1.2.2 干预方法 将实验组大鼠置于麻醉诱导箱中,通过调节七氟醚挥发罐和S/5多功能麻醉气体监测仪中设置七氟醚浓度,流量为2L/min,持续3h,对照组不做任何处理,术中使用电加热板维持体温36.5～37.5℃麻醉过程中观时刻察大鼠的皮肤颜色,防止出现呼吸抑制。

1.2.3 Morris水迷宫实验 实验程序：⑴定位航行实验一般被用来检测大鼠的学习和记忆的能力。此实验总共耗时6 d,这6d中总共对小鼠进行5次训练。在实验进行的过程中一直保持水温稳定在25℃左右,训练时,大鼠分别在四个象限1/2弧度处头朝池壁入水。由计算机记录大鼠从入水点入水到到达平台所消耗的总时间,如果大鼠在60s内未能到达平台,则计算机自动计时60s,再由实验人员负责引导大鼠,使其按直线游至平台,并且训练大鼠在平台上站立10 s,促进大鼠对平台的位置进行学习和记忆。此外,实验中还需观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需时间和距离,即记录其潜伏期和游泳距离。⑵空间搜索实验被用来测试大鼠对水池平台位置记忆的持续能力。在定位航行实验训练结束后,撤去水池中的平台,将大鼠置于水中,观察并记录大鼠第一次到达水池平台位置的时间以及在原平台所在象限中停留的时间。数据的采集以及处理都是由MWM自带的图像系统完成。

1.2.4 Wesern-blot法 采用Wesern-blot法对BDNFβ-actin、PSD-95以及Tau进行测定。在水迷宫实验结束后,使大鼠吸入5%七氟醚将其麻醉,再将大鼠处死并取其大脑中的海马区组织,再用裂解液提取总蛋白,测定其浓度,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法使目的蛋白分离,之后进行冰浴转膜,再在室温下用脱脂奶粉封闭1～2。封闭结束之后,依次加入BDNF抗体,PSD95抗体以及Tau抗体,4℃条件下孵育过夜,次日用二抗孵育1h后TBST洗膜三次,每次10min,最后用红外成像系统扫膜并采用Odessay软件测定灰度值,GAPDH为内参,用目的条带的灰度值与GAPDH条带的灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.2.5 ELISA法 采集脑脊液后将其置于-80℃冰箱中冷冻保存。采用ELISA法检测ApoE浓度。选取生物素化的抗大鼠ApoE抗体为一抗,辣根过氧化物酶标抗体为二抗。操作过程严格按照试剂盒说明书进行。最后采用酶标仪在波长450 nm处检测光密度值(OD值),根据OD值绘制ApoE的质量浓度曲线,根据ApoE的质量浓度曲线计算ApoE浓度。

2 结果

2.1 实验组大鼠和对照组大鼠的Morris迷宫实验指标对比 在出生后37d测定,实验组和对照组大鼠的Morris水迷宫实验中游泳路程、原平台象限游泳距离差异无统计学意义（P>0.05）,实验组大鼠的Morris水迷宫实验中逃避潜伏期、原平台象限滞留时间均较对照组长（P<0.05）；见表1。

2.2 实验组大鼠和对照组大鼠的海马组织中BD-NF、PSD-95、Tau蛋白表达情况比较 在出生后37d测定,实验组大鼠的海马组织中BDNF、PSD-95蛋白表达低于对照组（P<0.05）,Tau蛋白表达强度高于对照组（P<0.05）；见表2、图1。

表1 实验组大鼠和对照组大鼠的Morris迷宫实验指标对比（±s）

表1 实验组大鼠和对照组大鼠的Morris迷宫实验指标对比（±s）

组别n 游泳路程（mm）逃避潜伏期(s)实验组对照组t值P值24 24 9876.9±2201.3 10092.7±2568.4-0.315 0.754原平台象限滞留时间(s)31.05±3.26 29.11±3.31 2.066 0.044 27.84±4.49 25.20±5.13 2.022 0.049原平台象限游泳距离（mm）7430.2±1982.3 7550.7±1846.5-0.220 0.827

表2 实验组大鼠和对照组大鼠的海马组织中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表达情况比较（±s,相对表达强度）

表2 实验组大鼠和对照组大鼠的海马组织中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表达情况比较（±s,相对表达强度）

组别 n实验组对照组t值P值24 24 BDNFβ-actin PSD-95 0.961±0.271 1.309±0.332-4.010 0.000 0.733±0.154 0.941±0.187-4.240 0.000 Tau蛋白1.410±0.081 0.587±0.074 3.296 0.002

图1 海马组织中BDNF、PSD-95、Tau蛋白电泳图

2.3 实验组大鼠和对照组大鼠的脑脊液中ApoE水平比较 在出生后37d测定,实验组大鼠脑脊液中ApoE水平高于对照组（P<0.05）；见表3、图2。

表3 实验组大鼠和对照组大鼠的脑脊液中ApoE水平比较（±s）

表3 实验组大鼠和对照组大鼠的脑脊液中ApoE水平比较（±s）

组别 n实验组对照组P值24 24 ApoE（ng/ml） t值35.82±4.16 33.09±3.73 2.394 0.021

图2 实验组大鼠和对照组大鼠的脑脊液中ApoE水平柱状图

3 讨论

水迷宫实验是检测动物学习记忆能力最经典的实验之一,主要由定位巡航实验以及空间探索实验两部分组成[4]。其结果的重复性以及稳定性良好,逃避潜伏期能反映大鼠的学习能力,逃避潜伏期的长短与动物的陈述性记忆能力呈负相关的关系,逃避潜伏期越长,则陈述性记忆能力越差,反之,逃避潜伏期越短,则陈述性记忆能力越好,而在原平台所在象限滞留的时间能则反映大鼠的空间记忆能力[5]。本次的研究结果表明,大鼠在反复接受七氟醚的麻醉之后,实验组的逃避潜伏期以及在原平台滞留的时间与对照组相比都由明显的延长且具有统计学意义,这就表明大鼠在接受七氟醚的麻醉之后记忆能力下降了,提示长时间的七氟醚麻醉可能会导致大鼠的认知能力出现障碍。其他的研究也发现,大鼠的认知能力的障碍与七氟醚麻醉的时间呈正相关的关系,麻醉的时间越长,大鼠的认知能力受损也就越严重。

BDNF是成熟的神经元维持生存以及正常的生理功能所必需的,在大脑皮层以海马组织中分布较为集中,有促进神经元的发育、促进受损神经元恢复的功能,参与突触的可塑性,维持了中枢神经系统的学习与记忆能力[6]。PSD-95主要分布在突触后致密区,能调节谷氨酸受体的功能,,影响突触后可塑性。此次的研究结果表明,实验组大鼠的BDNF以及PSD-95的表达强度显著低于对照组的大鼠且差异具有统计学意义,大鼠的BDNF以及PSD-95的表达都出现了下调,表明海马神经元突触传递变弱,突触的可塑性受到抑制,提示七氟醚麻醉大鼠导致大鼠的认知能力受损可能与抑制海马体组织中神经元的突触可塑性有关。

Tau蛋白是在神经元中与微管有关的含量最高的蛋白,主要存在于神经元的轴突内,能促进微管的组装并保持其稳定性[7]。大量的实验研究提示,Tau蛋白的异常磷酸化与记忆认知能力退化有密不可分的关系。。在正常成熟的脑内平均仅仅只有几个生理性磷酸化位点,但在某些病理状态下,Tau蛋白异常的磷酸化位点远高于正常水平,报道的某些病理性磷酸化位点已经达到40个左右[8,9]。此外,Tau通过调节脯氨酸依赖性蛋白激酶来调节Tau蛋白的磷酸化的水平,这在体内实验中已经得到证实[10]。异常的过度磷酸化的Tau蛋白以配对螺旋丝的形式构成了神经原纤维缠结并且在神经细胞内积聚[11]。这些在神经细胞内积聚的缠结影响了神经元的正常功能,最终会致使神经细胞变性甚至是死亡[12]。此次研究中,实验组大鼠的Tau的表达强度显著高于对照组且具有统计学意义,这也提示我们,大鼠在吸入七氟醚麻醉之后,可能会导致Tau的过度表达而导致大鼠的认知能力受损。

ApoE是一种血浆蛋白,其主要的合成器官为肝脏,但是也可在大脑中表达,其主要在星形胶质细胞中合成[13]。ApoE与中枢神经系统的发育和受损后的修复等过程有密切的关系。有研究发现,脑内的ApoE过度表达可能与老年斑和神经纤维缠结形成有关,一种可能的机制为ApoE加剧了β-淀粉样肽的沉积,从而引起神经元受损和行为异常[14-16]。在此次研究当中,实验组大鼠脑脊液中的ApoE显著高于对照组大鼠,这也提示我们实验组大鼠在吸入七氟醚之后可能出现了β-淀粉样肽的沉积,从而导致大鼠的认知能力受损。

综上所述,大鼠在吸入七氟醚之后认知能力与正常组大鼠相比出现了一定的障碍,而且Tau与ApoE的表达显著升高,BDNF与PSD-95的表达显著降低,表明新生期大鼠吸入七氟烷对其神经及认知功能发育在早期有一定的影响。