廖子龙 张培荣 吴 泽

1.深圳市盐田区人民医院病理科 (广东 深圳 518000)

2.中南大学湘雅医院病理科 (湖南 长沙 410008)

BRAF基因是一种原癌基因，BRAFV600E位点突变导致细胞恶性增殖，从而促进肿瘤的发生发展。近年来学者发现BRAFV600E突变与甲状腺乳头状癌发病密切相关[1]。通过BRAF V600E基因检测与HE染色技术发现，BRAFV600E在甲状腺乳头状癌患者中的突变比例达90%[2]。而BRAFV600E抗体是一种鼠单克隆抗体(克隆VE1)，是针对BRAF突变氨基酸序列(氨基酸596到606 GLATEKSRWSG)的人工合成肽。全部实体瘤中约有8%可检出BRAFV600E突变，其中包括39%的乳头状甲状腺癌[3]。该抗体在免疫组化病理层面的临床应用有着重要的意义；特别在只能手工免疫组化染色的医疗单位，为其提供一项具有操作较为简单、费用低等优点的方法，也将给患者提供更有效的诊断证明和检查项目的选择。实验方法如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取甲状腺乳头状癌肿瘤标本，其中BRAFV600E在肿瘤细胞中强阳性表达的组织5例，采用相同的高压修复方式和同一批号的罗氏一抗试剂。以二抗滴加HRP30min设为实验组1，滴加ES(反应放大剂+高敏型酶标抗小鼠/兔IgG聚合物)并根据放大剂和聚合物的不同作用时间设为实验组2～8，分别为实验组2(放大剂15min+聚合物15min)、实验组3(放大剂30min+聚合物15min)、实验组4(放大剂60min+聚合物15min)，实验组5(放大剂30min+聚合物20min)，实验组6(放大剂30min+聚合物30min)，实验组7(放大剂30min+聚合物45min)，实验组8(放大剂30min+聚合物60min)，以使用全自动免疫组化仪配套罗氏试剂染色设立对照组；在相同条件下同时进行染色。

1.2 切片前期处理常规切片(厚3～4μm)，电热恒温箱65°C烤片2h以上，二甲苯脱蜡10min×3－无水酒精2min×2－95%酒精1min－90%酒精1min－80%酒精1min－水洗。

1.3 试剂与仪器BRAFV600E(VE1)抗体；DAB染色试剂盒：(1)Optiview Peroxidase Inhibiror(3%)；(2)Optiview HQ Universal Linker；(3)Optiview HRP Multimer；(4)Optiview DAB；(5)Optiview H2O2(0.04%)(6)Optiview Copper(上海罗氏诊断产品有限公司)。EDTA(PH9.0)修复液、HRP、ES、加强型DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。DHP-420型电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)。BenchMark XT 全自动免疫组化仪(上海罗氏诊断产品有限公司)。

1.4 免疫组化染色流程(1)全自动免疫组化仪染色：按照BRAFV600E该抗体设定好的染色程序进行染色，封片。(2)迈新试剂染色流程：EDTA(PH9.0)高压修复喷气后计时5min－H2O2(3%)37°C反应10min－BRAFV600E抗体37°C孵育60min－HRP 37°C孵育30min或ES 37°C孵育(按不同实验组设定的时间)min－加强型DAB显色试剂盒37°C作用10min－复染、封片。每个步骤间均用PBS+Tween 20液进行清洗3次，每次3min。

1.5 结果判读染色好的切片由副高以上病理诊断医师以及主管技师共同阅片，这种突变特异性抗体表现为一种细胞浆染色模式，对肿瘤BRAFV600E抗体明确表达部位进行对比分析，以对照组染色结果为标准，判断其表达强度；结果以阴性(-)、弱阳(+)、中阳(++)、强阳(+++)进行标注比较[4]。

2 结 果

实验组1和实验组2，表达均为(-)(见图1)。而5例实验组3、4以及2例实验组5表达为(+)；5例实验组6、3例实验组5以及1例实验组8表达为(++)；除了1例实验组8表达为(++)，其余实验组7、8均表达为(+++)。5例标本中对照组对BRAF V600E抗体均表达为(+++)(见图2)。

图1 BRAF V600E阴性(-)。图2 BRAF V600E强阳性(+++)。

组实验进行比较，5例标本在相同条件下呈现较高的一致性。实验组7和实验组8的表达强度与对照组的表达强度基本一致，但实验组7时间较短；该方法可用于甲状腺乳头状癌BRAFV600E抗体免疫组化项目检测。

3 讨 论

近年来，甲状腺乳头状癌作为甲状腺癌的主要肿瘤类型，其发病率逐年增高。研究表明，BRAF基因V600E突变检测在甲状腺乳头状癌诊断中具有重要的临床应用价值，该基因突变与甲状腺外侵犯、淋巴结或远处转移、肿瘤进展或复发密切相关[5-6]。基于基因检测时间长、费用高等因素，BRAFV600E抗体逐渐开始应用于病理免疫组化检测中。由于该抗体检测条件要求较高，目前并没有一个公认的较好的手工免疫组化操作方法。目前在罗氏全自动免疫组化仪加强型试剂染色效果较好，但仍有部分基层单位因各种原因未能使用全自动免疫组化仪；本项目通过对罗氏全自动染色流程的解读，对修复条件以及不同试剂的不同孵育时间进行摸索并试验，确定BRAFV600E抗体手工免疫组化染色的最佳染色条件[7-8]。实验结果显示，5例标本中对照组BRAFV600E抗体均表达为强阳性。各实验组间的表达结果呈现较高的一致性；其中实验组1和实验组2，结果显示均为阴性(-)，未能表达BRAFV600E抗体。而5例实验组3、4以及2例实验组5表达为弱阳性(+)；5例实验组6、3例实验组5以及1例实验组8表达为中阳性(++)；除了1例实验组8表达为中阳性(++)，其余实验组7、8均表达为强阳性(+++)(表1)。提示适当增加反应放大剂和高敏型酶标抗小鼠/兔IgG聚合物的反应时间可以增强表达效果；从实验组2至实验组7的表达强度上看，试剂1(反应放大剂)反应时间为30min的表达强度最佳，与反应时间为60min的表达强度是一致的；试剂2(高敏型酶标抗小鼠/兔IgG聚合物)随着时间延长表达强度明显增强，但反应30min与45min强度基本一致。因此，从表达强度和时间上考虑，选择反应30min最理想。在染色成本方面，主要计算一抗修复液、一抗试剂、二抗试剂以及显示试剂费用，该数据为根据厂家采购价粗略计算；实验组1每人份为42.12元，实验组2～8每人份为41.99元，对照组每人份为103.7元；如此看来，使用全自动免疫组化仪的染色成本明显高于手工染色，这也是一部分单位考虑的因素。在完成染色时限方面，从抗原修复开始至DAB显色结束进行计时，实验组1与实验组2用时最短，均为117min，实验组4与实验组8用时较长，为162min，实验组3、5用时132min，实验组6用时137min，实验组7用时为147min，而全自动免疫组化仪染色时间最长，为248分min，明显高于手工染色时间(表1)。

表1 5例实验组以及对照组的时效性、经济性对比情况

综上所述，本实验结果表明，使用全自动免疫组化仪染色效果最理想，但涉及仪器采购问题，染色时间较长，染色成本也较高； 而手工免疫组化染色中实验组7的染色效果较理想，能满足于病理诊断，染色时间较全自动免疫组化仪短，其费用也更低；为满足基层单位BRAFV600E抗体手工免疫组化染色的需求，本实验提供两家不同厂家、不同染色条件的手工免疫组化染色方法，可根据各单位需求做出选择。基于手工染色和结果判读上仍存在一定的人为因素，判读结果存在个别差异性。另本实验由于病例数较少，未能产生统计学意义，数据还需进一步积累分析；并且单一厂家实验试剂较局限，其他厂家试剂对BRAFV600E抗体的表达情况如何？还需进一步实验摸索。