脑缺血再灌注（I/R）损伤是指脑缺血一段时间再灌注后，缺血组织损伤和功能障碍不仅没有恢复，反而出现加重的现象，主要表现为血流动力学改变、脑组织梗死面积扩大、神经细胞自噬和凋亡异常等现象。目前，临床尚缺乏治疗脑组织I/R损伤的特效药物，防止I/R后大脑神经细胞的凋亡和氧化应激是保护I/R损伤的重要方法之一。原花青素是一种广泛存在于多种植物中的天然化合物，具有较强的清除自由基的能力和抑制凋亡的效果。但目前关于原花青素对脑I/R损伤的保护机制尚不完全统一。本研究于2018年6月至2019年5月旨在研究原花青素通过抑制Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信号通路对大鼠脑I/R损伤的保护作用，以期了解原花青素对大鼠I/R损伤的保护作用机理。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级3周龄SD雄性大鼠60只，体重（68.74±5.39）g，购自广东医学院实验动物中心，粤监证字2004A029号，饲养温度20～25℃，相对湿度50%～65%，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 药物与试剂

丙二醛、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase，LDH）检测试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、TLR4、NF-κB p65及NF-κB p65一抗购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶（HRP）羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司。

1.3 仪器

电子天平（BS-124s型），由北京赛多斯仪器系统有限公司提供；低温离心机（3-5w型），由湖南恒诺离心机有限公司提供；正置型金相显微镜（SG-51型），由上海光学仪器厂提供；蛋白电泳及转膜仪由美国Bio-Rad公司提供；MF-ChemiBIS凝胶成像系统由以色列DNR公司提供。

1.4 分组及建立模型

将60只大鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为对照组、模型组、原花青素低剂量组和原花青素高剂量组，各15只，并采用改良线栓法制成I/R模型，模型复制和造模成功标准均参考Wu等研究。具体操作如下：麻醉大鼠并仰卧固定，分离双侧颈总动脉，使用微动脉夹夹闭10 min，松开10 min，再夹闭10 min复制大鼠脑组织I/R模型。

1.5 药物干预

原花青素低剂量组和原花青素高剂量组，分别使用原花青素灌胃处理，剂量分别为：80 mg/kg和160 mg/kg，1次/天，共处理7 d。

1.6 检测项目

1.6.1

大鼠神经功能缺损情况检测 完成给药12 h后，实验Longa 5分法评价大鼠神经功能。

1.6.2

大鼠脑含水量检测 神经功能进行评分后，断脖处死大鼠，分离左右脑半球，快速称质量，计为湿质量。将大鼠左右脑半球放入恒温干燥箱干燥后称质量，计为干质量。

1.6.3

SOD、活性氧和GPX含量检测 断脖处死大鼠，分离腹主动脉血液，离心，按照试剂盒说明书检测丙二醛、SOD、活性氧和GPX水平。

1.6.4

蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达水平 取大鼠脑组织，使用胰蛋白酶消化后，提取总蛋白，依次进行电泳、转膜、封闭，加入一抗（Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白）孵育过夜，加二抗孵育2 h，显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对内参蛋白β-肌动蛋白（β-actin）的表达量。

1.6.5

大鼠神经细胞凋亡情况检测 大鼠脑组织切片常规脱水，严格按照DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL法）试剂盒说明书进行操作。400倍光学显微镜下，随机选取皮质区4个不重复视野，计算凋亡细胞指数（Apoptosis cell index，ACI）=（凋亡细胞总数/细胞总数）×100%。

1.7 统计学方法

本研究数据分析采用软件为SPSS 22.0，采用GraphPad Prism5软件制作柱状图，组间比较采用单因素方差分析；若

P

＜0.05则表明数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能缺损情况及脑含水量检测结果

相比对照组，模型组大鼠神经功能缺损评分及脑含水量升高（

P

＜0.05）；相比模型组，原花青素低剂量组大鼠神经功能缺损评分及脑含水量降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低剂量组，原花青素高剂量组大鼠神经功能评分及脑含水量降低（

P

＜0.05），见表1。

表1 大鼠神经功能缺损情况及脑含水量检测结果/±s

2.2 大鼠氧化应激水平检测结果

相比对照组，模型组大鼠SOD、GPX含量水平降低、活性氧含量水平升高（

P

＜0.05）；相比模型组，原花青素低剂量组大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低剂量组，花青素高剂量组大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低（

P

＜0.05），见表2。

表2 大鼠氧化应激水平检测结果/（U/mL，±s）

2.3 大鼠TLR4/NF

-κ

B信号通路检测结果

由蛋白质印记实验可以看出，相比对照组，模型组大鼠脑组织中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达水平升高（

P

＜0.05）；相比模型组，原花青素低剂量组大鼠脑组织中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达水平降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低剂量组，花青素高剂量组大鼠脑组织中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达水平降低（

P

＜0.05），见图1、表3。

2.4 大鼠凋亡蛋白表达检测结果

由蛋白质印记实验可以看出，相比对照组，模型组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达升高（

P

＜0.05）；相比模型组，原花青素低剂量组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低剂量组，花青素高剂量组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达降低（

P

＜0.05），见图2、表4。

图1 大鼠TLR4/NF-κB信号通路检测结果

表3 大鼠TLR4/NF-κB信号通路检测结果/±s

图2 大鼠凋亡蛋白表达检测结果

表4 大鼠凋亡蛋白表达检测结果/±s

2.5大鼠脑神经细胞凋亡检测结果

由染色实验观察大鼠脑细胞凋亡实验可以看出，相比对照组（5.01±1.21）%，模型组大鼠脑神经细胞凋亡数目（65.58±5.32）%显然增加（

P

＜0.05）；相比模型组，原花青素低剂量组大鼠脑神经细胞凋亡数目（41.32±4.80）%降低（

P

＜0.05）；相比原花青素低剂量组，花青素高剂量组大鼠脑神经细胞凋亡数目（22.14±4.09）%降低（

P

＜0.05），

F

=584.172，

P

＜0.001，见图3。

3 讨论

脑组织I/R损伤是脑动脉缺血后恢复血流灌注时，脑组织损伤加重的现象，与大量炎症介质释放、自由基生成、神经细胞凋亡等有关。最为显著的表现为当脑组织细胞受到损伤导致细胞破裂，细胞内的水分溢出导致脑含水量升高，神经功能受到影响。本研究发现，相比模型组，原花青素低剂量组大鼠神经功能评分及脑含水量降低。说明使用原花青素除了可以有效缓解大鼠脑I/R损伤，同时相比原花青素低剂量组，原花青素高剂量组大鼠神经功能评分及脑含水量降低，说明在一定剂量范围内随着使用原花青素处理的增加，其效果呈剂量依赖性。这可能是因为原花青素具有抑制炎症，并且通过抑制氧化反应，缓解大鼠脑损伤。有研究表明：原花青素可以有效降低I/R大鼠脑含水量并改善神经功能评分，本研究得出的结论与其相一致。

SOD是机体重要的过氧化物酶，可以清除体内过量的活性氧，减少脂质代谢中间产物MAD生成，减轻活性氧堆积引起的氧化应激损伤。本研究发现，相比模型组，使用原花青素处理的各组大鼠SOD、GPX含量水平升高、活性氧含量水平降低。说明原花青素可以有效抑制氧化应激反应，同时当使用原花青素浓度升高后效果更为显著。这可能是因为原花青素中含有多酚化合物，这些多酚化合物具有很强的抗氧化性，有效缓解了I/R大鼠脑组织中的过氧化反应，缓解了大鼠的I/R损伤。

NF-κB广泛存在于真核细胞内，可以调节多种免疫炎症介质释放，改变肿瘤生长的微环境，调节肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学过程。等研究显示，TLR4/NF-κB信号通路激活还可以调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达，诱导细胞的凋亡。本研究发现，相比模型组，原花青素低剂量组大鼠脑组织中TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达水平降低且Bcl-2蛋白表达升高、Bax蛋白表达也降低。说明原花青素可以抑制TLR4蛋白和NF-κB蛋白表达，实现抑制TLR4/NF-κB信号通路并影响下游凋亡相关基因的表达，保护大鼠脑神经细胞缺血后的凋亡，缓解了I/R损伤。有研究表明：原花青素可以抑制TLR4/NFκB信号通路，本研究结果与其基本一致。

Caspase家族基因是体内调控细胞凋亡的主要基因，包括凋亡启动蛋白Caspase-9、凋亡执行蛋白Caspase-3等。已有研究显示，一旦细胞接收到凋亡信号，Caspase-9可以活化Caspase-3，进入细胞核，降解多种重要的蛋白，导致细胞凋亡。本实验中可以看出，相比模型组，原花青素低剂量组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达升高、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达降低。说明使用原花青素可以有效降低凋亡基因Caspase家族蛋白的表达，这可能是因为原花青素可以抑制凋亡基因上游信号通路，使得下游的凋亡基因表达受到抑制。李浩等研究表明：原花青素可以通过降低凋亡相关蛋白表达，抑制脑细胞的凋亡实现保护脑I/R损伤，本研究得出的结论与其相一致。

综上所述，原花青素过抑制TLR4/NF-κB信号通路调控下游凋亡蛋白的表达抑制I/R大鼠脑细胞的凋亡缓解脑I/R损伤。但本实验由于经费和时间限制使用的大鼠有限，涉及到的预处理时间存在一定的限制，在后续的实验中将进一步增加样本量，分别在I/R前后不同的时间使用不同浓度的原花青素作用大鼠，观察不同时间使用原花青素作用对大鼠I/R后行为学评估，脑含水量及相关信号通路的表达的影响。

图3 大鼠凋亡蛋白表达检测结果（TUNEL法×400）： A为对照组；B为模型组；C为原花青素低剂量组；D为原花青素高剂量组