马朝阳

摘要：选择性剪接是真核生物转录水平上的一个重要环节。它是主要通过5种剪接模式，依靠剪接复合体删减mRNA前体分子中内含子并拼接外显子，形成成熟mRNA的一个过程。通过对不同剪接位点的选择，产生不同类型的剪接产物，大大增加蛋白质的多样性和基于表达的复杂程度。研究表明，植物体内的选择性剪接参与生长发育过程，能够调节机体生理功能的实现与否。

关键词：选择性剪接;剪接复合体;剪接因子;植物生长

1.选择性剪接的发现

选择性剪接，又称可变剪接（alternative splicing），指通过不同的剪接方式从mRNA前体分子（pre-mRNAs）中切除被称为内含子（intron）的非编码区，并使基因中被称为外显子的（exon）的编码区拼接为成熟mRNA的过程[1]。在RNA剪接过程中，机体如何正确识别内含子的剪切位点并进行剪接尤为重要。根据内含子的碱基序列和潜在折叠方式的差异，剪接方式可以分为3种方式：pre-mRNA剪接、Ⅰ类和Ⅱ类自剪接内含子。

从1977年，Sambrook 发现外显子和内含子的间隔排列而成之后，人们认识到一个真核基因大多是断裂的，必须去除内含子连接外显子才能发挥基因的作用[2]。1978年Gilbert[3]明确提出选择性剪接这一概念后，选择性剪接成为人们广泛的研究领域。随后大量的研究表明，选择性剪接是一个存在于多细胞生物的普遍现象，真核生物的基因中内含子所占比例很高，比如在人类萎缩性肌强直因子中超过99%。其中，植物前体mRNA选择性剪接的研究最早追溯于1989年Wernekeetal.发现RCA基因在菠菜和拟南芥中均可发生选择性剪接，以相同的剪切模式和剪接位点分别形成41、45kd和44、47kd两个同源体[4]。

2.RNA可变剪接的模式

随着人们对酵母和人类等的深入研究，了解到选择剪接的模式主要分为以下5种：

①外显子跳跃（exon skipping）：指的是外显子遗漏性剪接，即当一个外显子连同它两端的内含子一起被剪接，而不能在成熟mRNA中出现时，我们说这个外显子被跳过，结果是机体最终的成熟mRNA删除了一个或几个外显子。

②互斥外显子（mutually exclusive exons）：即相互排斥剪接，意思是一组外显子只选择其中之一剪接为成熟mRNA。

③5’端选择性剪接（5’ Alternative splicing）：指可变的5’剪接位点与内含子保守5’剪接位点相竞争，且能与该内含子的3’剪接位点相互作用发生选择性剪接的过程。

④3’端选择性剪接（3’ Alternative splicing）：可变的3’剪接位点与内含子保守3’剪接位点相竞争，且能与该内含子的5’剪接位点相互作用发生选择性剪接的过程。

⑤内含子保留剪接（Intron reserved splicing）：在剪接过程中选择性保留整个内含子或部分内含子序列，使其成为成熟 mRNA 的一部分[5]。

3.选择性剪接的机制

3.1RNA序列决定剪接位点

比较不同真核生物基因的核苷酸序列，发现mRNA前体中内含子区域存在共同序列，意味着这些序列可能是mRNA前体发生剪接的信号。内含子的5’端剪接位点被称为供体位点（donor site），3’端剪接位点被称为受体位点（acceptor site）[6]。研究表明，细胞核mRNA前体内含子的5’端边界序列为GU，3’端边界序列为AG，这种保守序列被称为GU-AG法则（又称Chambon法则），在所有剪接位点类型中所占比例为99.24%。除此之外，生物体内也存在0.7%GC-AG型内含子和0.05%[7]GU-AG型内含子，两者可能以相同的剪接机制参与剪接过程[4]。

进一步研究表明，外显子与内含子的交界处序列，及内含子内部的部分序列也是保守序列，可能参与剪接位点的选择。目前已知，3’端剪接位点AG附近有一段富含10—20个嘧啶核苷酸的区域（Py rich），5’端剪接位点GU附近有一保守序列（5’-GUPuAGU-3’）。同时，在距离3’端上游18-50个核苷酸处也存在一段保守序列，其中的腺嘌呤（A）在不同基因mRNA前体分子中都存在，且含有2’-OH，构成了剪接过程中的分支点[8]。

参与剪接过程的装置识别mRNA前体分子的剪接位点后，需要经过两步转酯反应才能完成整个过程。第一步：位于分支点的保守腺苷酸残基的2’-OH对5’剪接位点的鸟苷酸磷酸基团进行亲核攻击，使得游离出来的5’磷酸基团与2’-OH形成5’-2’磷酸二酯键，伴随套索结构（lariat form）的形成。第二步：外显子3’端核苷酸的-OH亲核攻击内含子3’端的磷酸基团，使得内含子在3’剪接位点断裂，释放套索结构，促使两个外显子成功连接[6]。这两个环节重复一次，一个完整的内含子被切除，直至完成mRNA的剪接工作。

3.2剪接复合体的组分及功能

参与上述转酯反应的装置是剪接复合体（spliceosome），它是介导内含子剪接位点准确识别的保障，主要组分是核小RNA蛋白复合体（small nuclear ribonucleo-protein particle，snRNP）和其他多种蛋白质因子[9]。研究表明，剪接复合体包含约150种蛋白质和5种RNA，核小RNA蛋白复合体由U1、U2、U4/U6和U5的5种核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和与这些RNA相结合的蛋白质组成，每种snRNA长度大约100—300bp核苷酸[8]。除U6外，每个snRNA均含有一个3’端甲基鸟苷帽子结构，存在特定的保守序列[10]。

snRNP在剪接过程发挥着重要作用，其作用过程如下：U1snRNA以碱基互补配对的方式与5’端剪接位点结合，U2snRNA与3’端剪接位点上游的分支点结合，进而形成剪接前体（pre-spliceosome）。U2snRNA的结合需要辅助因子U2AF（U2 auxiliary factor）的引導，U2AF由分子量为65kDa和35kDa的两个亚基组成，65kDa亚基结合在3’端剪接位点AG附近的富嘧啶区，35kDa亚基结合在3’端剪接位点AG保守序列处[11]。接着，剪接前体进一步与U4、U5、U6-snRNP三聚体相结合，组装成60S的剪接复合体，从而通过两步转酯反应完成整个pre-mRNA的剪接过程。

3.3剪接因子調控选择性剪接

除去核小RNA蛋白复合体，剪接复合体中的其他多种蛋白质因子都参与剪接因子的形成。这包括富含精氨酸和丝氨酸的蛋白（Ser-Arg rich protein，SR蛋白）、hnRNP、RNA螺旋酶、激酶等。

目前研究表明，SR蛋白家族十分庞大。高等生物体内参与剪接过程的具有RS结构域的蛋白约有50种，并且依据它们各自结构域的特征和功能，可以大致分为3类：①7种经典SR蛋白——此类蛋白C端为SR结构域，N端为1至2个RRM （RNA-recognition motif）;②SR类似蛋白：③其他含有RS结构域的蛋白[12]。SR蛋白家族调控的机制是改变其在剪接复合体中的位置，选择性识别和结合5’端和3’端剪接位点，从而调控选择性剪接。过程基本如下：SR蛋白家族能够与外显子或内含子的顺式作用元件识别，如外显子剪接增强子（ exon splicing enhancer，ESE）、内含子剪接增强子（intronic splicing enhancer，ISE）、外显子剪接沉默子（ exon splicing silencer，ESS）和内含子剪接沉默子（intronic splicing silencer，ISS），从而增强或减弱其对5’端和3’端剪接位点的识别的作用[13]。比如，SR蛋白结合到ESE上，不仅能够促进U1snRNP 对mRNA前体5’端剪接位点的识别结合，还能加强与3’端剪接位点的U2AF的35kDa亚基的相互作用，促使U2snRNA的辅助因子U2AF 结合至3’端剪接位点，从而增强了U2snRNA对分支点的结合能力[14]。

核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）是由分子量为58kD的多聚嘧啶区域结合蛋白（PTB）和RNA组成，参与mRNA的剪接过程[15]。由于PTB能够与U2AF竞争3’端剪接位点上游的富核苷酸的区域，使得hnRNP具有抑制剪接的作用。

4.选择性剪接参与植物生长发育

植物中，选择性剪接的具体功能涉及抗病及应对非生物环境压力、发育调节等多个方面。以拟南芥为例，选择性剪接体现在以下几种生长发育的过程中：①参与春化诱导的开花过程和生物钟调节过程;②对抗植物所处环境的高盐、低温、高温、干旱、重金属等非生物因素的胁迫;③防御机体免受各种病原体（包括病毒，真菌，细菌，昆虫等）的生物攻击;④参与半自主性细胞器叶绿体、线粒体种基因的选择项剪接，发挥其特定功能。

具体来说，当外界环境发生变化时，植物由于自身固着生长的属性，不能像动物那样可以躲避或迁徙以规避各种逆境的伤害，所以在其进化的过程中形成了适应逆境的机制，选择性剪接便是极为重要的一种。研究表明，选择性剪接可以在信号转导分子、转录因子、剪接因子和抗逆功能蛋白等4个层面相互协调，调控植物抗逆基因的表达。比如，与盐胁迫相关的拟南芥SOS4（salt overly sensitive 4）基因以及水稻OsTM基因编码的产物分别与调节Na+和 K+的动态平衡和清除活性氧有关，它们都可发生选择性剪接产生2个转录本，2个转录本之间的含量比值受盐胁迫的调控[16]。

除此之外，植物的生长发育各个阶段都伴随着选择性剪接过程的发生，其中较为典型的是发挥生物钟调节作用，因此选择性剪接被又称为植物体中的温度计。比如，拟南芥的生物钟受到多个基因的协同调控作用，其中CCA1/LHY 和TOC1是重要的三个调节基因[17]。

5.展望

选择性剪接以剪接复合体为主要装置，在剪接因子参与调控的背景下，通过两步转酯反应，形成5种选择性剪接的模式，使一个基因可以产生多个转录本和多个蛋白产物，大大增加蛋白质的多样性和基于表达的复杂程度。这是选择性剪接的基本功能。但总体上看，比起对动物基因的研究远远不够，自然界植物中仅有少量基因选择性剪接功能比较清楚，很多未知的剪接变体尚未发现，已知剪接变体的具体功能也并不完全了解。随着转录组测序技术水平的提高，越来越多的剪接变体将会被发现，认识到这些不同剪接变体的具体功能有助于理解基因功能多样性，也是今后研究选择性剪接参与植物生长发育过程功能的一个重要方向。

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指导老师：金燕