徐人杰，马进进，周晓强，虞 宵，颜勇卿，杨志杰，杨惠林，赛吉拉夫，陈广祥

创伤、肿瘤、先天畸形、炎症所致骨缺损临床十分常见。目前修复骨缺损的方法主要包括自体骨移植、异体及异种骨移植、人工合成骨替代材料移植等。自体骨移植一直被认为是骨缺损修复的金标准[1]，因其来源有限，易造成取骨部位的继发性损伤，临床应用受到限制；异体及异种骨移植存在潜在免疫排斥及传播疾病的风险。人工合成骨替代材料具有良好的生物学性能，是破解骨缺损难题的重要发展方向。

磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）主要由钙、磷组成，其成分与骨基质的无机成分相似，具有良好的生物相容性，目前在医学中常用的是β-TCP。该材料降解较快，疲劳强度低，脆性大，因此限制了其在高负荷部位植骨的应用。甲基丙烯酸酰化明胶（methacrylate gelatin，GelMA）是一种光敏性生物材料，配合光引发剂使用可在蓝光或紫外光下迅速交联固化，形成具有一定强度的三维结构。其生物相容性优异，可良好支持细胞的增殖及迁移，并可负载肿瘤细胞、心肌细胞、软骨细胞等多种细胞。本研究将纳米β-TCP与GelMA复合，探讨复合水凝胶的生物相容性及其对骨再生的促进作用，为人工合成骨替代材料的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

GelMA 固体海绵、光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰膦酸锂（Sigma 公司，美国）；纳米β-TCP（苏州鼎安科技有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国）；青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Percoll 细胞分离液（上海源叶生物科技有限公司）；1×PBS 缓冲液（Merck 公司，美国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测试剂盒、RIPA 裂解缓冲液（上海碧云天生物科技有限公司）；CCK-8 细胞检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

E10000 万能力学试验机（instron 公司，美国）；细胞培养箱、生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；超低温–80℃冰箱（海尔集团公司）；倒置荧光显微镜（Zeiss公司，德国）；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；Micro-CT（Kontich 公司，比利时）；多功能酶标仪（Bio-TEK 公司，美国）；电子天平（上海天平仪器厂）；培养皿、细胞培养板、1.5 mL EP 管（Corning 公司，美国）；离心管（上海晶安生物科技有限公司）。

1.2 水凝胶制备

向0.5 g GelMA 固体海绵中加入10 mL PBS，置于37℃水浴锅中溶解至透明状液体，加入0.025 g光引发剂，溶解后得到质量浓度为5%w/v的GelMA溶液（以下简称GelMA溶液）。取1 mL GelMA溶液滴于12孔培养板板孔中，以波长405 nm蓝光光源照射1 min，得到固化GelMA 水凝胶备用。取200 mg纳米β-TCP粉末加入1 mL GelMA溶液中，混匀后取1 mL混合溶液（质量浓度为20%w/v）滴于12孔培养板的板孔中，以波长405 nm蓝光光源照射1 min，得到固化的纳米β-TCP/GelMA复合水凝胶备用。

1.3 实验动物

清洁级健康SD 大鼠购自苏州大学动物实验中心[动物许可证号SCXK（苏）2017-0006]，雌雄不限。

1.4 大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的提取和培养

参照文献[2]方法取6 周龄SD 大鼠，断颈处死，放入75%乙醇中浸泡10 min，无菌条件下离断双下肢，剔除附着肌肉和结缔组织，取股骨和胫骨，切除骨两端，以含10%胎牛血清的DMEM 培养液冲洗骨髓腔，得到骨髓细胞悬液。在悬液中加入等量PBS，以1 000 r/min 的转速离心10 min，弃上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基至5 mL，重悬。在15 mL离心管中预先加入10 mL密度为1.073 g/mL 的Percoll 细胞分离液，缓慢铺上骨髓细胞悬液，以2 000 r/min转速离心30 min。抽取交界处白膜层细胞，加入2 倍体积PBS，以1 000 r/min 转速离心10 min，洗涤2 遍后，弃上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，接种于直径15 cm 的培养皿中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。5 d 后换液，以后每2～3 天换液一次。当贴壁细胞融合至80%时，按1∶2 比例传代。取生长状态良好的第3代BMSCs备用。

1.5 细胞共培养及颅骨缺损大鼠模型分组实验

根据共培养材料的不同分为空白对照组、GelMA 组、纳米β-TCP/GelMA 组。按5×104个/孔的细胞浓度将BMSCs 种于12 孔培养板不同分组孔，每组加入1 mL 含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的α-MEM 完全培养基，在培养基上加入0.5 mL 成骨诱导培养液（0.05 mmol/L维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 mmol/L地塞米松），置于37℃、5% CO2培养箱中培养，在不同时相点进行电镜观察、细胞增殖实验和ALP 染色检测。

取18 只8 周龄SD 大鼠，重量（250±50）g，参照文献[3]方法制作颅骨缺损模型。盐酸氯胺酮（100 mg/kg）联合噻拉嗪（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，令大鼠俯卧，固定头部和四肢。于大鼠头顶正中取纵行直切口，切开骨膜，以电动手术钻钻取直径8 mm骨窗。无菌生理盐水冲洗伤口，去除碎骨组织。将大鼠随机分为3组，每组6只。其中空白对照组直接逐层缝合皮肤；GelMA组、纳米β-TCP/GelMA 组分别将制备好的光固化GelMA 水凝胶和光固化纳米β-TCP/GelMA 复合水凝胶（规格相同，均为直径8 mm、厚度1 mm）填充于颅骨缺损处，然后逐层缝合皮肤。大鼠清醒后移至饲养房，按实验动物饲养要求喂养。每天注射30 万单位青霉素，连续3 d。术后4、8周每组各取3只动物，过量麻醉处死，取颅骨标本待用。

1.6 观察指标

1.6.1 材料力学性能 纳米β-TCP/GelMA水凝胶固化后，以万能力学试验机测量其抗压强度，并与GelMA水凝胶组对比。

1.6.2 大鼠BMSCs形貌及增殖、成骨性能

1.6.2.1 电镜观察 材料表面培养BMSCs 48 h，以2.5%戊二醛固定，30%～100%乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金镀膜，扫描电镜观察材料表面BMSCs状态。

1.6.2.2 细胞增殖实验 采用CCK-8 法[4]观察BMSCs 与材料共培养后的增殖情况。细胞共培养1、3、5 d，将种植于不同材料上的细胞充分消化、吹打、离心定容，接种于96孔培养板，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，37℃细胞培养箱中孵育2.5 h。以多功能酶标仪在450 nm处测定吸光度值，每个样品平行测试6次。

1.6.2.3 ALP 染色 细胞共培养7 d，将种植于不同材料上的细胞充分消化、吹打，接种于96 孔培养板，待细胞贴壁后行ALP染色。

1.6.3 大鼠颅骨缺损成骨情况

1.6.3.1 Micro-CT检查Micro-CT扫描大鼠颅骨标本，观察骨缺损区成骨情况。选择感兴趣区域计算骨量分数（bone volume/tissue volume，BV/TV）和骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.6.3.2 组织学检查 将标本浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，脱钙，制备石蜡切片，常规行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨缺损区域新骨形成情况。

1.7 统计学方法

应用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。CCK-8实验中不同分组吸光度值、BV/TV和BMD比较进行方差分析，组间两两比较采用Student'st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料力学性能比较

GelMA水凝胶组和纳米β-TCP/GelMA水凝胶组的杨氏弹性模量分别为（36.3±2.2）、（44.8±4.0）kP（at=–3.192，P=0.033）。

2.2 3组大鼠BMSCs形貌、增殖及成骨性能比较

2.2.1 电镜结果 大鼠BMSCs 与材料共培养48 h，其在GelMA 水凝胶和纳米β-TCP/GelMA 水凝胶复合材料表面均有良好的贴附及铺展（图1），提示两种材料均具有良好的生物相容性。

图1 共培养48 h大鼠BMSCs在材料表面贴附和铺展的扫描电镜图片1A GelMA水凝胶材料1B 纳米β-TCP/GelMA水凝胶材料（×3 000）

2.2.2 CCK-8 检测结果 如图2 所示，3 组大鼠BMSCs与材料共培养1、3、5 d，细胞数量随时间推移而不断增加；共培养3、5 d时，3组中纳米β-TCP/GelMA组OD值最高，与其他两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示其可显著促进细胞增殖，为细胞提供良好的生长条件。

图2 大鼠BMSCs与各组材料共培养不同时相点OD值（*两组比较，P ＜0.05）

2.2.3 ALP染色 大鼠BMSCs 与材料共培养7 d的ALP染色结果如图3所示，与GelMA组相比，纳米β-TCP/GelMA 组ALP 表达明显增强，提示其具有优异的体外促成骨性能。

图3 大鼠BMSCs与各组材料共培养7 d碱性磷酸酶染色

2.3 3组大鼠颅骨缺损区成骨情况比较

2.3.1 Micro-CT 检查 术后4 周，空白对照组骨缺损边缘较模糊，有少量新生骨；GelMA组骨缺损边缘有散在新生骨；纳米β-TCP/GelMA 组骨缺损面积显著减小，新生骨连接成片。术后8周，空白对照组骨缺损边缘较模糊，有少量新生骨；GelMA组骨缺损边缘有新生骨连接成片状；纳米β-TCP/GelMA 组骨缺损面积显著减小，骨缺损中央区域有大片状新生骨（图4）。

图4 3组大鼠颅骨缺损区术后4、8周Micro-CT

3 组4、8 周BV/TV、BMD 见图5 和图6，从低到高分别为空白对照组、GelMA 组、纳米β-TCP/GelMA 组，纳米β-TCP/GelM 组与空白对照组及GelMA组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图5 3 组大鼠颅骨缺损区术后4、8 周骨量分数（*两组间比较，P ＜0.05）

图6 3组大鼠颅骨缺损区术后4、8周骨密度（*两组间比较，P ＜0.05）

2.3.2 组织学检查 术后4周，空白对照组骨缺损内充满大量纤维组织；GelMA 组骨缺损边缘有少量红色新骨生成，其内分布少量新生毛细血管；纳米β-TCP/GelMA组骨缺损周围有较多红色新骨和新生血管形成。术后8周，空白对照组缺损内依然充满大量纤维组织，边界有少量红色新骨；GelMA组骨缺损可见较细长的红色新骨；纳米β-TCP/GelMA组骨缺损中间区域有丰富的红色新骨及微血管网络（图7）。

图7 3组大鼠颅骨缺损区术后4、8周组织学观察（苏木精-伊红染色，黄色箭头标记为红色新骨，上图为×25，下图为×100）

3 讨论

1920 年，Albee 和Morrison[5]首次将磷酸钙材料用于骨修复。一个世纪过后，磷酸钙材料已广泛应用于牙科、口腔颌面外科和骨科领域，包括牙周缺损修复，创伤、炎症、骨肿瘤所致骨缺损修复以及脊柱融合[6-11]等。既往认为，磷酸钙材料仅具有骨传导性，但近期研究表明，某些磷酸钙材料具有骨诱导性[12]。在体内，磷酸钙材料多孔和粗糙的结构可以捕获和富集骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等骨诱导因子和骨祖细胞；而磷酸钙材料上形成的碳酸盐磷灰石层则有助于蛋白质黏附和骨祖细胞附着、增殖、分化并产生细胞外基质，最终导致生物矿化或骨骼形成[13]。

TCP可根据结构分为α-TCP 和β-TCP，因α-TCP 降解速度过快，骨缺损修复主要采用β-TCP。其在水中可部分溶解，产生钙磷离子后被人体吸收，是构成骨骼的主要原料。缺点在于强度低，韧性差，影响其在负重区域的植骨应用。

RGD序列是广泛存在于细胞外基质中的氨基酸序列，为11种整合素配体提供识别位点，在细胞黏附、生长中发挥重要作用。明胶是胶原的降解产物，富含RGD 序列，具有良好的组织相容性和生物活性。然而，明胶机械强度差，降解速度快，与骨组织修复速度不匹配。2000 年Van den Bulcke 等[14]利用甲基丙烯酸酐取代明胶侧链氨基团，借助紫外线照射水溶性光引发剂，启动自由基聚合交联明胶，成功获得GelMA。与明胶相比，GelMA 水凝胶机械强度增加，降解性能改善[15]。Benton 等[16]构建用于培养主动脉瓣间质细胞的GelMA 支架，取得良好效果；亦有学者将GelMA水凝胶作为构建组织工程软骨的生物材料，用于骨科手术[17]；GelMA 还可支持角质形成细胞的生长、分化和分层，成为具有屏障功能的表皮[18]。

本研究基于GelMA 水凝胶构建骨组织工程三维微环境，有利于细胞黏附。电镜结果显示，BMSCs 在GelMA 水凝胶和纳米β-TCP/GelMA 水凝胶复合材料表面均有良好的贴附及铺展，生物相容性良好；CCK-8 测试结果则表明，添加纳米β-TCP 后，可增强GelMA 水凝胶的促细胞增殖能力，这一结果与既往文献报道相符[19]。

成骨细胞分化过程中分泌的ALP是早期骨形成的标志物，ALP 染色可反映成骨细胞活性。本研究结果发现，纳米β-TCP/GelMA 组ALP 染色强于GelMA 组、空白对照组，提示纳米β-TCP/GelMA水凝胶可进一步促进成骨细胞分化。大鼠颅骨缺损区Micro-CT 和组织学检查结果亦证实，纳米β-TCP/GelMA 水凝胶能够显著促进成骨，其具有协同增强骨再生能力的作用，这与Fang 等[20]GelMA 水凝胶支架进一步促进成骨的作用相仿。与此同时，纳米β-TCP/GelMA 水凝胶为软膏状可注射骨修复材料，光固化前可任意塑形，光固化后具有更好的维持形态能力，不易被体液冲散，便于操作，实用性强，适于填充不规则形的骨缺损区域。但力学测试结果显示，纳米β-TCP/GelMA 水凝胶复合材料抗压强度较低，只能用于非负重区域的植骨。未来针对这一问题，将在材料学方面进一步深入研究，力争开发出力学性能更强的人工合成骨替代材料。