杨 璇 刘小鹏 彭 宇 甄 然 宋彬彬 李 阔 于 佳

富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)突变是PD最为常见的遗传因素，LRRK2突变所致的PD发病年龄晚，在临床表现上与特发性PD更为接近[1]。因此，对LRRK2生理病理功能机制的解释对于阐释帕金森病发病机制至关重要。LRRK2表达异常可导致小鼠运动功能障碍，但是其中的具体机制目前仍不明确[2]。本实验将利用LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠，明确LRRK2的表达或功能异常对纹状体神经元多巴胺受体1(dopamine receptor 1，D1R)含量的影响，并探讨LRRK2调节纹状体神经元中D1R的机制，为丰富人们对LRRK2参与帕金森病发病机制的认识提供理论依据。

材料与方法

1.实验动物：LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠及野生型对照组，饲养在美国国立卫生院老年病研究所，根据实验动物相关管理规定进行操作和处理[3～5]。

2.主要试剂：大鼠单克隆D1R抗体购自美国Sigma公司，兔单克隆抗体NeuN购自英国Abcam公司，山羊多克隆组织蛋白酶D(cathepsin D)抗体购自美国R&D Systems公司，驴血清购自美国Jackson Immuno Research公司，牛血清白蛋白购自美国Sigma公司，荧光二抗、抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)购自美国Invitrogen公司。

3.免疫荧光染色：小鼠进行腹腔麻醉，沿胸旁正中线切开皮肤、剪断肋骨、暴露心脏。在心尖处剪开左心室，插入灌流针至左心室，剪开右心耳。先用PBS灌流，冲净血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。取脑后继续固定过夜，再放入30%蔗糖溶液中进行脱水。沿鼠脑冠状面做冰冻切片，厚度为40μm，将切片浸泡于PBS置于4℃保存。配制PBST(含0.3% Triton X-100)缓冲液，用封闭液(含10%驴血清和1%牛血清白蛋白的PBST)孵育脑片1h，然后4℃一抗孵育过夜，清洗3遍；……